2013 Fiscal Year Annual Research Report
ポリADPリボシル化によるクロマチン構造制御の包括的理解と分子メカニズム解析
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13J07144
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
藤木 克則 東京大学, 分子細胞生物学研究所, 特別研究員(PD)
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| Keywords | ポリADPリボシル化 / 次世代シーケンサ |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、PAR化修飾によるクロマチン構造制御が関わる未知の生命現象の探索と、その分子メカニズムの解明である。
本年度においては、当初の計画通り、まずビオチン化NADを用いてPARをラベルし、これを免疫沈降し次世代シーケンサを用いてPARのゲノムワイドな分布を解析することを目的として研究を行った。しかしながら研究の途上において、ビオチン化NADを用いる方法はこの解析に不適当であることが明らかになった。この方法ではではこの試薬を細胞に取り込ませるために細胞膜を部分的に透過性にする必要があり、いかに穏やかな条件で細胞の処理をおこなっても、細胞への障害によりPARPが過剰に活性化し、正しくゲノム上のPARの分布を解析できなくなってしまう恐れがあったためである。
そこで今度は、PARとの結合能力が報告されているマクロドメインタンパク質を利用してPARの解析を試みた。マクロドメインを持つヒトHistone macroH2A1.1遺伝子からマクロドメインと核内移行配列を取り出し、これに免疫沈降をおこなうためのmycタグをつけたPARプローブを作製した。このプローブを対象の細胞中において強制発現させ、mycタグのクロマチン免疫沈降によりPAR化されたゲノム領域を濃縮し次世代シーケンサによって解析をおこなった。その結果、PARは遺伝子の転写開始位置に強く分布すること、また遺伝子の転写レベルに応じて遺伝子上で異なる分布を示すことが明らかとなった。このデータは、PARが遺伝子の転写に何らかの働きを持つということを強く示唆していた。さらに、遺伝子内のエキソンとイントロンでもまた違った分布をしており、PARのスプライシングへの寄与も示していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の初年度の達成目標通り、次世代シーケンサによるPAR化領域の解析技術の開発に成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
次世代シーケンサによるPAR化領城の解析技術・及びそこから得られるデータをもとにPARによるクロマチン制御メカニズムの解明につとめる予定である。
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