2014 Fiscal Year Annual Research Report
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13J08353
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
熊崎 薫 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | タンパク質膜組み込み / Ｘ線結晶構造解析 / ＹｉｄＣ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は，細菌の内膜において，タンパク質膜組み込みに重要な役割を果たす2つの膜タンパク質「YidC」と「Secトランスロコン」が，どのように協調して機能しているのかを調べるために，グラム陰性菌である大腸菌由来YidC (EcYidC) のX線結晶構造解析に取り組んだ．EcYidCの細胞外ドメインは，Secトランスコロンと相互作用することにより，YidCのシャペロンとして働きを助け，効率的なタンパク質膜組み込みに重要であることが知られている．これまでに詳細な立体構造が報告されている，グラム陽性菌であるBacillus halodurans由来YidC (BhYidC) はこの細胞外ドメインを持っておらず，Secトランスコロンとの複合体形成への構造基盤は不明のままであった．
まず，EcYidCを大腸菌に過剰発現させ，大腸菌細胞膜を界面活性剤ドデシルマルトシドにより可溶化し，ニッケルアフィニティークロマトグラフィー，プロテアーゼによるHisタグの切断，ゲルろ過クロマトグラフィーという過程により精製した．精製タンパク質に対し脂質キュービック相法による結晶化スクリーニングを行い，良質な結晶が得られた．この結晶を用いて大型放射光施設SPring-8にてX線回折実験を行ったところ，最大分解能3.2 Aの回折データを得ることに成功した．結晶構造が既知である可溶性ドメインとBhYidCの結晶構造をサーチモデルとした分子置換法により，3.2 A分解能でEcYidCの結晶構造を決定した．EcYidCの結晶構造に対し，これまでに報告されたSecトランスコロンとの相互作用部位をマッピングすることにより，YidCがシャペロンとしての機能する際に形成するSecトランスコロン-YidC複合体についての構造的な示唆が得られた．本研究成果をまとめた論文は，Scientific Reports誌に掲載された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
大腸菌由来YidC (EcYidC) のX線結晶構造解析に成功し、その結晶構造から、YidCがSecトランスロコンと協調して機能する際の構造基盤の一端を明らかにすることができた。本成果をまとめた論文はScientific Reports誌に掲載され、研究は計画以上に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、Secトランスロコン-リボソーム複合体の精製、結晶化を行い、X線結晶構造解析を目指す。
また、昨年度および今年度の研究により、YidCが基質タンパク質とどこで相互作用しているかが明らかとなった。このような新しい知見が得られたため、基質タンパク質とYidCの共結晶化を行い、その基質認識機構や膜組み込みの詳細な分子機構を解明することを目指す。
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[Journal Article] A hydrophilic microenvironment required for the channel-independent insertase function of YidC2015
Author(s)
Shimokawa-Chiba, N., Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nureki, O., Ito, K., Chiba, S.
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Journal Title
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
Volume: 112
Pages: 5063-5068
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Structural basis for Sec-independent membrane protein insertion by YidC.2014
Author(s)
Kumazaki, K., Chiba, S., Takemoto, M., Furukawa, A., Nishiyama, K., Sugano, Y., Mori, T., Dohmae, N., Hirata, K., Nakada-Nakura, Y., Maturana, A.D., Tanaka, Y., Mori, H., Sugita, Y., Arisaka, F., Ito K., Ishitani, R., Tsukazaki, T. and Nureki, O.
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Journal Title
Nature
Volume: 509
Pages: 516-520
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Crystal structure of Escherichia coli YidC, a membrane protein chaperone and insertase2014
Author(s)
Kumazaki, K., Kishimoto, T., Furukawa, A., Mori, H., Tanaka, Y., Dohmae, N., Ishitani, R., Tsukazaki, T., and Nureki, O.
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Journal Title
Scientific reports
Volume: 4
Pages: 7299
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of YidC, a membrane-protein chaperone and insertase from Bacillus halodurans.2014
Author(s)
Kumazaki, K., Tsukazaki, T., Nishizawa, T., Tanaka, Y., Kato, H.E., Nakada-Nakura, Y., Hirata, K., Mori, Y., Suga, H., Dohmae, N., Ishitani, R. and Nureki, O.
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Journal Title
Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications
Volume: 70
Pages: 1056-1060
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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