2014 Fiscal Year Annual Research Report
組換えホットスポット活性化因子Ｐｒｄｍ９の機能解析と抑制因子の探索
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13J08945
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
河野 宏光 東京大学, 理学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2013-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 組換えホットスポット / 減数分裂 / 相同染色体組換え / 野生マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに本研究は、哺乳類の組換えホットスポット活性化因子であるPrdm9の野生マウスにおける多様性を明らかにしており、この成果を生かしPrdm9の機能解析をすべく本年度は以下のアプローチで研究を行った。
1. Prdm9 ノックインマウスの作成による機能解析
マウスPrdm9遺伝子内のDNA結合ドメインを決定するZinc Finger Array (ZFA) は非常に多様であることが知られており、Prdm9の機能に強い影響を与えていると考えられる。そこで我々はCre-loxシステムを応用し、ZFA領域のみを容易に改変可能なノックインマウスを作成した。結果、ZFA直後にエピトープタグ配列を付加したマウスでも改変していないマウスとほぼ変わらない表現型だった。この結果は抗体が入手困難なPrdm9の機能を解析する上で、既知の抗エピトープタグ抗体を用いた免疫沈降に代表される実験手法が適応できる可能性につながるものである。同時に、前々年度でクローニングを行ったマウスの多様なZFAやZFAなしのコンストラクトを導入することで、部分的に機能ドメインが欠失したPrdm9の機能解析や、ZFA領域の配列多様性への制約などを実験により示すことができる。
2. Prdm9結合配列を用いた組換え検出マウスの作成による抑制因子の探索
存在が予測されているPrdm9抑制因子の探索は、存在すると思われる染色体領域のリシーケンシングを保持系統マウスで行い結果を得たが大きな違いはなく、具体的な抑制因子候補の選定には至らなかった。そこで再度組換え頻度を求めるために、Psmb9遺伝子近傍のPrdm9結合配列と汎用プロモーター、EYFPを利用して、組換えが起こった精子で蛍光が観察され、その割合から組換え頻度を求めることができるマウスを作成している。現在、遺伝子型が完成型のマウスが得られておりその解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
「Prdm9の機能解析」はノックインマウスを作成できたため、Prdm9の重要と考えられるZFAの領域だけを1世代で自由に抜き差しできる構造をもった系統を手に入れたことになり、機能解析に向けたタンパクの実験を行う段階である。
「抑制因子の探索」は、抑制因子が存在すると思われる領域の配列を解析したが、有望な多型などを発見することはできず、また解読の難しい繰り返し構造が一部にあったため完全な配列の比較はできていない。そこで、改めて精子を用いて組換え頻度を測定できる検出系マウスの作成を行っており、現在組換え頻度が精子の蛍光に反映されているかを確認している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は以上の2点を軸として進めているが、どちらもマウス系統の樹立と交配に予想以上に時間がかかり少し遅れている。しかし昨年度までで系統の樹立は完了しており、ここから免疫沈降など実際に発現したタンパク質に対する解析を行うことで、年度内に研究を完遂することができると考えられる。特にPrdm9タンパク質の機能解析に関しては、これまでに得られた結果や材料を利用することで、多様性という点で当初よりも厚みのある結果を期待することができると考えられる。
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Research Products
(1 results)
