蛋白質動的高次構造検出法の開発及びそれを用いた蛋白質構造・機能相関の解明

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14001004
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 北川 禎三 岡崎国立共同研究機構, 統合バイオサイエンスセンター, 教授 (40029955)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内田 毅 岡崎国立共同研究機構, 分子科学研究所, 助手 (30343742) ; 水谷 泰久 神戸大学, 分子フォトサイエンス研究センター, 助教授 (60270469)
• Keywords: 蛋白質動的構造 / 時間分解振動分光 / 共鳴ラマン分光 / センサー蛋白質 / 温度ジャンプ / DNA結合蛋白 / 赤外線分光 / DNAフォトリアーゼ

Research Abstract

サブナノ秒の紫外共鳴ラマン測定システムの製作にとりかかった。その光源として、206,220,229,及び244nmの4波長のレーザー光が0.1nsのパルス幅、1kHzの繰り返しで発振するようになった。これとは別のピコ秒可視レーザー光を光源とする時間分解共鳴ラマン分光の実験においては、一酸化炭素ミオグロビンのCO光解離後の超高速蛋白ダイナミクスを調べた。鉄-ヒスチジン伸縮振動の振動数が時定数100psで高波数シフトする事を見つけた。その時定数が溶液の粘度を上げると長くなり、両者を対数プロットするとほぼ直線上にのった。この事から蛋白構造全体が100ピコ秒の時定数で変化する事がわかった。センサー蛋白としては、HemATとDosを調べた。HemATは細菌の化学走性を生み出すセンサーで、酸素に向かって泳いでいく生理シグナルを作り出す。この蛋白の酸素付加体の鉄-酸素伸縮振動によるラマンバンドを同位体置換法で帰属した。2本の同位体鋭敏バンドが観測された。1本は酸素が根元側原子で蛋白と強く水素結合しているもの、もう1本は遠位側原子で水素結合しているものに帰属した。その相対強度は、シグナル伝達部を切って短くしていくと変化した。この事により、この蛋白の特異的酸素認識機構は、酸素と蛋白との水素結合によると推定された。一方、大腸菌の酸素センサー蛋白であるDosは自然な状態では6配位低スピンのヘムをもち、その軸配位子はHis77とMet95でないかと推定された。そのCO付加体の共鳴ラマンスペクトルから、Met95がCOと置換すると推定された。アポミオグロビンの酸変性状態から自然な形に折りたたまれていく過程を時間分解紫外共鳴ラマン分光法で追跡した。時間分解能100マイクロ秒の高速混合装置を製作し、混合フロー法で測定した。A, G, Hヘリックスは150μsで既にでき上がっており、1ms領域にもう一つの中間体を与えた後5msでモルテングロビュール状態となった。自然な形になるのに40msかかった。

Research Products

• [Publications] T.Kitagawa, N.Haruta, Y.Mizutani: "Time-resolved resonance Raman study on ultrafast structural relaxation and vibrational cooling of photodissociated carbonmonoxy myoglobin"Biopolymers(Biospectroscopy). 67. 207-213 (2002)
• [Publications] M.Aki, T.Ogura, Y.Naruta, T.H.Le, T.Sato, T.Kitagawa: "UV resonance Raman characterization of model compounds of Tyr244 of Bovine cytochrome c oxidase in its neutral-, deprotonated anion-, and deprotonated neutral radical-forms ; Effects of covalent binding between tyrosine and histidine"Journal of Physical Chemistry. 106. 3436-3444 (2002)
• [Publications] S.Aono, T.Kato, M.Matsuki, H.Nakajima, T.Ohta, T.Uchida, T.Kitagawa: "Resonance Raman and ligand binding studies of the oxygen sensing signal transducer protein HemAT from Bacillus subtilis"Journal of Physical Chemistry. 277. 13528-13538 (2002)
• [Publications] N.Haruta, T.Kitagawa: "Time-resolved UV resonance Raman investigation of protein folding using a rapid mixer : Characterization of kinetic folding intermediates of apomyoglobin"Biochemistry. 41. 6595-6604 (2002)
• [Publications] Y.Mizutani, T.Kitagawa: "Vibrational energy relaxation of metalloporphyrins in a condensed phase probed by time-resolved resonance Raman spectroscopy"Bulletin of the Chemical Society of Japan. 75. 623-639 (2002)
• [Publications] A.Sato, Y.Sasakura, S.Sugiyama, I.Sagami, T.Shimizu, Y.Mizutani, T.Kitagawa: "Stationary and time-resolved resonance Raman spectra of His77 and Met95 mutants of the isolated heme domain of a direct oxygen sensor from Escherichia coli"Journal of Biological Chemistry. 277. 32650-32658 (2002)