遺伝子組換え担子菌を用いた内分泌攪乱物質分解システムの構築

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14042230
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 本田 与一 京都大学, 木質科学研究所, 助教授 (70252517)
• Keywords: 環境ホルモン / バイオレメディエーション / 白色腐朽菌 / 遺伝子組換え / リグニン分解

Research Abstract

担子菌類(きのこの仲間)のリグニン分解能力を利用して環境中の内分泌撹乱物質を分解除去する系は、他の生物には見られない多種多様な汚染物質に対して有効な点が特徴である。これは、担子菌の中でも白色腐朽菌類は、一般に菌体外に分泌するラッカーゼやペルオキシダーゼによって初発される連鎖的ラジカル反応によって、高分子リグニンの低分子化を促し、これによって生成する多様な芳香族有機化合物を分解・資化するとされている。このため、白色腐朽菌は多環式・複素環式芳香族化合物や高塩基置換性の芳香族化合物など、バクテリア等では分解が難しい毒性化合物の分解をできることが知られている。本研究では、研究代表者が自ら開発を行ったリグニン分解性担子菌Pleurotus ostreatus(ヒラタケ)への遺伝子導入システムを利用して、内分泌攪乱物質分解能が高度に高められた「遺伝子組換え担子菌」を作製する目的で、高分子基質や非フェノール性芳香族化合物をも直接分解することが可能な、多機能型のマンガンペルオキシダーゼを発現するための組換えmnp2遺伝子を形質転換導入して遺伝子組換え体を単離し、分解能が高められた株のスクリーニングを行った。
ヒラタケのmnp2遺伝子を単離して、これまでに作成されたsdi1遺伝子の発現シグナルを有する組換えプラスミドpTM1上で、制限酵素的にコード領域の置き換えを行って組換えプラスミドpIpM2gの構築を行った。この発現プラスミドをP.ostreatusに導入するため、カルボキシン耐性マーカープラスミドpTM1との共形質転換を行った。選択薬剤としてカルボキシン2μg/mlを含む再生培地上でコロニーを作る形質転換体を単離した。これらの形質転換株に対しPCR法による検出を行い、mnp2発現プラスミドpIpM2gも導入された共形質転換株を42株単離した。このようにして得られた株を用いて、培地中に高分子色素PolyR-478を含む培養条件下で多機能型ペルオキシダーゼの生産能についてスクリーニングしたところ、野生型に比べて高い分解能を持つ組換え体が7株見つかった。

Research Products

• [Publications] T.Irie, T.Sato, K.Saito, Y.Honda, T.Watanabe, M.Kuwahara, H.Enei: "Construction of a homologous selectable marker gene for Lentinus edodes transformation"Biosci.Biotechnol.Biochem. 67. 2006-2009 (2003)
• [Publications] Kamitsuji, H., Y.Honda, T.Watanabe, M.Kuwahara: "Production and Induction of Manganese Peroxidase Isozymes in a White-rot Fungus Pleurotus ostreatus"Appl.Microbiol.Biotechnol. (in press). (2004)
• [Publications] 本田与一(共著): "きのこ学への誘い"海青社(印刷中). (2004)