可視光照射により硬化するゼラチンを担体とした培養細胞系を用いた関節軟骨の再生

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14207055
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 満渕 邦彦 東京大学, 大学院・情報理工学系研究科, 教授 (50192349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 武久 九州大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60142189) ; 池川 志郎 理化学研究所, 遺伝子多型研究センター, チームリーダー(研究職) (30272496) ; 鈴木 隆文 東京大学, 大学院・情報理工学系研究科, 科学技術振興特任教員(常勤形態) (50302659) ; 中山 泰秀 国立循環器病センター研究所, 生体工学部, 室長(研究職) (50250262) ; 中村 耕三 東京大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60126133)
• Keywords: 可視光重合性ゼラチン / 関節軟骨再生 / tvpe II コラーゲン / 間質系幹細胞 / ラディカル / アグリカン / カンファキノン / 担体

Research Abstract

2002年度は、当初の予定に従い、以下の如く研究を行なった。
1.光硬化したゼラチン内で軟骨細胞が生着・増殖し、軟骨基質を産生する最適条件の検討
光硬化したゼラチン内に封入した細胞が生着・増殖し、軟骨基質を産生するための最適条件に関するin vitroにおける検討を行った。具体的には、1)光重合性ゼラチンに関して、スチレン化率の変化、ポリエチレングリコール(PEG)の混入などを行い、光硬化した際の物理特性の最適化、および、封入した軟骨細胞の生着・増殖、ならびに軟骨基質産生との両立を図った。2)細胞のゼラチン内封入時の至適細胞密度の検討を行う。3)光重合性ゼラチン自身、およびその重合性開始剤として用いているカンファキノンの細胞毒性、光照射時に放出されるラディカルなどの影響とその対策について検討を行った。4)ゼラチンを硬化させる際の照射する光のパワーと照射時間の最適条件について検討を行った。
これらの評価実験には、関節軟骨細胞、および、多分化能を有する細胞系(骨髄由来の間葉系細胞など)を用い、結果に関しては、a)組織像による産生された軟骨基質染色性の比較,b)半定量性RT-PCRによる軟骨特異的な基質蛋白(typeII, X, XI collagen(s), aggrecanなど)のmRNA発現量の比較により評価を行った。
2.光硬化したゼラチン内に封入した細胞による軟骨基質産生のin vivo study
上記のin vitroで確認されたゼラチン内培養軟骨細胞の軟骨基質産生が、生体内でも同様に再現されるか否かの確認を行った
実験系としては、日本白色家兎の大腿骨膝蓋窩に軟骨欠損を作製し、培養軟骨細胞を封入した光硬化性ゼラチンをin situで硬化させ、一定期間(3週間)の後、コントロールとの比較を、肉眼的所見、組織像、及び再生軟骨の物性値(硬度・弾性など)によって行なった。
結果として、in vivoで適用した場合、ゼラチンのロットによっては、硬化させたゼラチンが比較的早期に吸収されてしまい、長期の包埋の後には残っていない例が少なからず存在した。おそらく、不純物の除去が十分でなく、光照射時生じたラディカルがこの不純物に吸収されるためにゼラチンの重合率の低下が生じたためと考えられ、現在、ゼラチンのスチレン化の後の透析を十分に行い、再度検討中である。
3.最適な光硬化ゼラチンの設計
現在、硬化させた際の構造が2層化するような-即ち、内層は柔らかで、ガスや養分が通り易く、細胞が増殖しやすいが、外層は強度・硬度が強くなるような-光重合性ゼラチンを考案中である。

Research Products

• [Publications] Ikeda T., Ikegawa S., et al.: "Association analysis of single nucleotide polymorphisms in cartilage-specific collagen genes with knee and hip osteoarthritis in the Japanese population"J.Bone Miner Res.. 17(7). 1290-1296 (2002)
• [Publications] Ikeda T., Ikegawa S., et al.: "Identification and characterization of the human long form of Sox5 (L-SOX5) gene"Gene. 298(1). 59-68 (2002)
• [Publications] Okino H., Matsuda T., et al.: "Novel Therapeutic Strategy for Prevention of Malignant Tumor Recurrence after Surgery : Local Delivery and Prolonged Release of Adenovirus Immobilized in Photocured, Tissue-Adhesive Gelatinous Matrix"J.Biomedical Material Research. (in press).
• [Publications] Okino H., Tanaka M., Matsuda T.: "Limited Efficacy of Passive Transport-Driven Thans-Tissue Gene Delivery via Adenovirus-Immobilized Matrix"Journal of Controlled Release. (accepted).
• [Publications] Hoshikawa A., Mabuchi K., et al.: "Use of Photoreactive Gelatin as a Carrier for Chondrocyte Transplantation"Journal of Orthopaedic Research. (accepted).