EBウイルスをモデルとした真核細胞DNA複製の酵素学的解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14208079
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 正井 久雄 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (40229349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885) ; 高井 裕子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (90332270) ; 須賀田 直子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (30344071) ; 玉井 克之 (株)サイフレックス, 代表取締役 ; 白形 正樹 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (70251551)
• Keywords: Epstein Brrr Virus / in vitro DNA複製 / MCM複合体 / ORC複合体 / preRC / oriP / EBNAタンパク質 / 細胞周期

Research Abstract

1.リコンビナントEBNA1タンパク質の精製と活性確認
oriP DNAを鋳型とするin vitro複製系の構築に必須なリコンビナントEBNA1蛋白質を作製した。数種のコンストラクトを作製し、最終的にN末にGSTを融合した全長EBNA1が比較的高レベルで安定した発現を示したのでこれを核画分から単離精製した。この蛋白質がin vitroでoriP DNA結合活性を持つことをゲルシフトアッセイにて確認し、さらにヒト細胞用発現ベクターに同一の遺伝子を構築、その発現下でoriPの一過性の複製能を支持することを確認した。
2.in vivoでのoriP DNA複製機序の経時的解析
EBNA1蛋白質を恒常的に発現する細胞株(以下EB1/S3)を作製し、導入したoriPがどの段階で複製能を獲得していくかをDpnIアッセイにて解析した。その結果、少なくとも導入後初回はS期後期に複製を開始することが判明した。この結果は、in vivoではoriPの複製タイミングが何らかの制御を受けてS期前半では抑制されている可能性を示唆し、oriP回収条件の確立に有用な知見となった。
3.OriP DNAエピソームの単離調製条件の確立
EB1/S3細胞に導入し数回複製したoriPを、宿主細胞の複製複合体を結合した状態で生理的に単離精製する条件を検討した。エピソームの抽出条件を決定し、スクロース密度勾配にてoriP DNA-蛋白質複合体を含む画分を同定してその蛋白質解析を行ったところ、Cdc6やRPAなど一部の前複製複合体構成因子または複製因子が共に分画されていることが判明した。さらに、oriP導入細胞を同調させ細胞周期ごとに回収して解析したところ、G1期の細胞ではoriPエピソームが明らかに高分子画分にシフトしており、oriPが前複製複合体と結合した状態で単離された可能性を示唆した。今回確立した方法により、様々な活性化段階のpre-およびpost-複製複合体をoriP DNAと結合させて回収できるだけでなく、in vitro複製系の鋳型としてポテンシャルの高いoriPを能率良く単離することができる。
4.EBNA1タンパク質の精製とin vitroにおけるpreRC構築の為の実験系確立のための準備
MBP-EBNA1タンパク質を大腸菌において大量に発現、精製した。さらに、細胞からクロマチン構造を有するoirPプラスミドを回収するために、SV40複製起点とのcomposite repliconを作製した。これを用いてCos7細胞などから大量のクロマチン鋳型DNAを回収し、精製EBNA1と粗抽出液あるいは精製タンパク質を組み合わせてin vitroにおいて複製能を有するpreRCの構築を目指す。

Research Products

• [Publications] Kim, J.M., Nakao, K., Nakamura, K., Saito, I., Katsuki, M., Arai, K., MASAI, H.: "Inactivation of Cdc7 kinase in mouse embryonic stem cells results in S phase arrest and p53-dependent cell death"EMBO Journal. 21. 2168-2179 (2002)
• [Publications] Yamada, M., Sato, N., Taniyama, C., Ohtani, K., Arai, K., Masai, H: "A 63 base-pair DNA segment containing a Sp1 site but not a canonical E2F site can confer growth-dependent and E2F-mediated transcriptional stimulation of the human ASK gene encoding the regulatory subunit for human Cdc7-related kinase"Journal of Biological Chemistry. 277. 27668-27681 (2002)
• [Publications] Tanaka, T., Mizukoshi, T., Taniyama, C., Kohda, D., Arai, K., Masai, H.: "DNA binding of PriA protein requires cooperation of the N-terminal D-loop/arrested-fork binding and C-terminal helicase domains"Journal of Biological Chemistry. 277. 38062-38071 (2002)
• [Publications] Masai, H., Arai, K.: "Cdc7 kinase complex : A key regulator for initiation of DNA replication"Journal of Cellular Physiology. 190. 287-296 (2002)
• [Publications] Tanaka, T., Taniyama, C., Arai, K., Masai, H.: "ATPase/helicase motif mutants of Escherichia coli PriA protein essential for recombination-dependent DNA replication"Genes to Cells. 8. 251-261 (2003)
• [Publications] You, Z., Ishimi, Y., Masai, H., Hanaoka, F: "Roles of Mcm7 and Mcm4 subunits in DNA helicase activity of mouse Mcm4/6/7 complex"Journal of Biological Chemistry. 277. 42471-42479 (2002)
• [Publications] 松影昭夫, 正井久雄 編: "ゲノムの複製と分配"シュプリンガー・フェアラーク東京. 234 (2002)