EBウィルスをモデルとした真核細胞DNA複製の酵素学的解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14208079
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 正井 久雄 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (40229349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 釣本 敏樹 九州大学, 理学部, 教授 (30163885) ; 高井 裕子 財団法人東京都医学研究機構, 主任研究員 (90332270) ; 須賀田 直子 財団法人東京都医学研究機構, 主任研究員 (30344071) ; 玉井 克之 (株)サイクレックス, 代表取締役 ; 白形 正樹 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (70251551)
• Keywords: Epstein Brrr Virus / in vitro DNA複製 / MCM複合体 / ORC複合体 / preRC / oriP / EBNAタンパク質 / 細胞周期

Research Abstract

潜伏感染期のEpstein-BarrウィルスのゲノムDNAはウィルス由来のタンパク質EBNA-1の存在下で1細胞周期あたり1回複製され、その複製開始や進行は宿主由来の因子に依存していると考えられている。oriP領域はその複製起点の一つであり、この領域をもつプラスミドDNAはEBNA-1発現ヒト細胞内で安定に複製維持される。我々は、哺乳動物の複製起点が未だ十分解明されていない現時点で、oriPプラスミドはヒトのゲノムDNA複製の開始制御機構を分子レベルで解明できるモデルレプリコンであると考え、in vitroでのDNA複製反応系の構築を目指している。昨年度、細胞に導入したoriPの複製能獲得時期や、複製開始・完了時期の特定、および分画したエピソーム画分にpreRC(prereplicative complex ;前複製複合体)構成タンパク質が含まれることを明らかにした。本年度はさらに、このエピソームDNA/タンパク質複合体のサイズが細胞周期に応じて特異的に変動することや、複製したoriPの一部が核マトリクスに強固に結合していること、さらに、EBNA-1依存性複製は、Cdc7キナーゼの機能に依存することを見いだした。また、実際に細胞内でEBNA-1依存的に複製しているエピソームの動態解析と並行して、in vitroでoriPプラスミド上にヒトのpreRCを構築する実験系の開発を進めている。先ず、クロマチン構造をとった鋳型プラスミド(ミニ染色体)を多量に得るため、oriPの他にSV40のoriを組み込み、SV40-T抗原発現細胞で多コピーに増幅させる工夫をした。更に、細胞抽出液からそのミニ染色体を簡便且つ特異的に単離するための工夫として、鋳型プラスミドに特定のDNA結合タンパク質の認識配列を組み込み、そのDNA結合タンパク質を固定化したアフィニティー・ビーズで精製する新手法も開発中であり、間もなく実用可能になろうかという段階に至っている。また、oriP上でpreRC形成の中心核となる筈のEBNA-1を組換え体タンパク質として作成した。
以上の成果を土台として、今後、ヒトのpreRCを特定DNA部位に形成させるin vitro反応系の構築を目指す。

Research Products

• [Publications] Tanaka, T., Taniyama, C., Arai, K., Masai, H.: "ATPase/helicase motif mutants of Escherichia coli PriA protein essential for recombination-dependent DNA replication"Genes to Cells. 8. 251-261 (2003)
• [Publications] Sato, N., Sato, M., Nakayama, M., Saitoh, R., Arai, K., Masai, H.: "Cell cycle regulation of chromatin binding and nuclear localization of Cdc7-ASK kinase complex"Genes to Cells. 8. 451-463 (2003)
• [Publications] Kim, J.M., Takemoto, N., Arai K., Masai, H.: "Hypomorphic mutation in an essential cell-cycle kinase causes growth retardation and impaired spermatogenesis"EMBO Journal. 22. 5260-5272 (2003)
• [Publications] Mizukoshi, T., Tanaka, T., Arai, K., Kohda, D., Masai, H.: "A critical role of the 3'-terminus of nascent DNA chains in recognition of stalled replication forks."Journal of Biological.Chemistry. 278. 42234-42239 (2003)
• [Publications] You, Z., Ishimi, Y., Mizuno, T., Sugasawa, K., Hanaoka, F., Masai, H.: "Thymine-rich single-stranded DNA sequences specifically activate mouse Mcm4/6/7 helicase on Y-fork and bubble-like substrates."EMBO Journal. 22. 6148-6160 (2003)
• [Publications] Furukohri, A., Sato, N., Masai, H., Arai, K., Sugino, A., Waga, S.: "Identification and characterization of a Xenopus homolog of dbf4, a regulatory subunit of the cdc7 protein kinase required for the initiation of DNA."Journal of Biological Chemistry (Tokyo).. 134. 447-457 (2003)
• [Publications] 正井久雄: "DNAとそれを認識する蛋白質の多様性と普遍性 蛋白質 核酸 酵素 特集 DNA二重らせん構造の半世紀(1)"共立出版. 589-591 (2003)