EBウイルスをモデルとした真核細胞DNA複製の酵素学的解析

2004 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14208079
• Research Institution: Tokyo Metropolitan Organization for Medical Research
• Principal Investigator: 正井 久雄 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (40229349)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 須賀田 直子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (30344071) ; 高井 裕子 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 主任研究員 (90332270) ; 森山 賢治 財団法人東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (00250217) ; 釣本 敏樹 奈良先端科学技術大学院大学, バイオサイエンス研究科, 助教授 (30163885) ; 白形 正樹 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (70251551)
• Keywords: Epstein Brrr Virus / in viitro DNA複製 / MCM複合体 / ORC複合体 / preRC / oriP / EBNAタンパク質 / 細胞周期

Research Abstract

潜伏感染期のEpstein-BarrウィルスのゲノムDNAはウィルス由来のタンパク質EBNA-1の存在下で1細胞周期あたり1回複製され、その複製開始や進行は宿主由来の因子(ORC, MCMなど)に依存していると考えられている。我々は、oriPプラスミドをモデルレプリコンとしてin vitroでのDNA複製反応系の構築を目指している。昨年度までに、細胞に導入したoriPの複製能獲得時期、複製したoriPの一部が核マトリクスに強固に結合していること、さらに、EBNA-1依存性複製は、Cdc7機能に依存することなどを見いだしている。本年度は、クロマチン上でのpreRC構築をin vitroで再現するために、ヒト培養細胞に一過的に導入した自律複製プラスミドを環状ミニ染色体として簡便に単離する方法を確立した。このために、1)培養細胞内でプラスミドを複製・増幅させるためにSV40の複製起点を導入し、トランスフェクション効率が高く増殖の盛んなSV40T抗原発現細胞を宿主とすること、および2)プラスミドにtet operator配列を複数導入し、その特異的吸着および回収のために組換え体tet repressorを固定化したアフィニティー担体を利用すること、という2つの改良を試みた。これにより、細胞抽出液からoriPプラスミド染色体を簡便且つ特異的に単離することが可能になった。現在、単離したクロマチン鋳型上において、精製したEBNA1,ORC, MCMタンパク質による複合体形成の解析をすすめている。さらに、preRC形成のために必要なタンパク質のなかで、MCMタンパク質はすでに、大量に精製して保持していたが、本年度はORC複合体を精製するために、その発現系の構築ならびに精製をこころみ、複合体を精製できる見通しがたった。

Research Products

• [Journal Article] Cell cycle and developmental regulations of replication factors in mouse embryonic stem cells. (2005)
  • Author(s): Fujii-Yamamoto, H., Kim, J-M., Arai, K., Masai, H.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 12976-12987
  • Description: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [Journal Article] A second human Dbf4/ASK-related protein, Crf1/ASKL1 is required for efficient completion of S and M phases. (2005)
  • Author(s): Yoshizawa, N., Ishii, A., Taniyama, C., Matsui, E., Arai, K., Masai, H.
  • Journal Title: J.Biol.Chem. 280 Pages: 13062-13070
• [Journal Article] Functional analyses of mouse ASK, an activator subunit for Cdc7 kinase, using conditional ASK knockout ES cells. (2005)
  • Author(s): Yamashita, H., Kim, J-M., Koiwai, O., Arai, K., Masai, H.
  • Journal Title: Genes to Cells (In press)
• [Journal Article] Genetic dissection of mammalian Cdc7 kinase : Cell cycle and developmental roles. (2004)
  • Author(s): Kim, J-M., Masai, H.
  • Journal Title: Cell Cycle 3 Pages: 300-304
  • Description: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [Journal Article] Functional interaction between tumor suppressor menin and activator of S-phase kinase. (2004)
  • Author(s): Schnepp, R.W., Hou, Z., Wang, H., Petersen, C., Silva, A., Masai, H., Hua, X.
  • Journal Title: Cancer Res. 64 Pages: 6791-6796
  • Description: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [Journal Article] Overexpression of CR/periphilin downregulates Cdc7 expression and induces S-phase arrest. (2004)
  • Author(s): Kurita, M., Suzuki, H., Masai, H., Mizumoto, K., Ogata, E., Nishimoto, I., Aiso, S., Matsuoka, M.
  • Journal Title: Biochem.Biophys.Res.Commun. 32 Pages: 554-561
  • Description: 「研究成果報告書概要(欧文)」より