ペルオキシダーゼに対するカタラーゼ活性賦与:過酸化水素との反応の制御機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14209019
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 渡辺 芳人 名古屋大学, 大学院・理学研究科, 教授 (10201245)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 上野 隆史 名古屋大学, 物質科学国祭研究センター, 助手 (70332179)
• Keywords: 西洋ワサビペルオキシダーゼ / カタラーゼ / ヘム

Research Abstract

昨年までの研究では、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)のミュータントを作成してカタラーゼ活牲の検討を行ってきたが、蛋白質の不溶化のために大量発現ができないためにサンプル量が少なく、再現性を得るまでの実験が出来なかった。そこで、今年度は他の機能性蛋白質との融合化によってホロ型の可溶性HRPの発現と精製を試みた。
具体的には、グッルタチオン-s-トランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン(TRX)、ジスルフィドイソメラーゼ(DsbC)とHRP蛋白質との融合化を試みた。各蛋白質のC末端に40残基程度のリンカー部を挟んで、HRPのN末端に繋がるように原核生物発現用プラスミドを調整した。
最終的に、TRX-HRP融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させることに成功した。現在、精製法の検討を行っており、高効率で蛋白の発現-単離精製が可能となれば、活性試験に移行できる段階に入る。
上記の研究と平行して、HRPと同様の酸化活性種を与えるヘムタンパク質であるミオグロビンミュータントを用いたカタラーゼ反応の作用機構の分子レベルでの検討を行っている。現時点で明確になった点は、酸化活性種による過酸化水素の酸化的分解反応は二種類存在し、イオン的な反応機構とラジカル機構による反応が競争し、ヘム遠位側に一般酸塩基となりうるヒスチジン残基が存在する場合は前者、一般酸塩基不在の場合は後者の機構でカタラーゼ反応が進行する。特に、後者の機構については、反応の速度論的な取り扱いによって、トンネル効果に基づく10以上の同位体効果(KH/KD)を観測している。

Research Products

• [Publications] T.Abura, S.Ogo, Y.Watanabe, S.Fukuzumi: "Isolation and Crystal Structure of Water-Soluble Iridium Hydride. Robust and Highly Active Catalyst for Acid-Catalyzed Transfer Hydrogenations of Carbonyl Compounds in Acidic Media"J.Am.Chem.Soc. 125. 4149-4154 (2003)
• [Publications] S.Fukuzumi, K.Shimoosako, T.Suenobu, Y.Watanabe: "Mechanisms of Hydrogen-, Oxygen-, and Electron-Transfer Reactions of Cumylperoxy Radical"J.Am.Chem.Soc. 125. 9074-9082 (2003)
• [Publications] H.Furutachi, M.Murayama, A.Shiohara, S.Yamazaki, S.Fujinami, A.Uehara, M.Suzuki, S.Ogo, Y.Watanabe, Y.Maeda: "Regioselective Hydroxylation of the Xylyl Linker in a Diiron(III) Complex having a carboxylate-Rich Ligand with H2O2"J.Chem.Soc., Chem.Commun.. 1900-1901 (2003)
• [Publications] H.Yang, T.Matsui, S.Ozaki, S.Kato, T.Ueno, G.N.Phillips, Jr., S.Fukuzumi, Y.Watanabe: "Molecular Engineering of Myoglobin : Influence of Residue 68 on the Rate and the Enantioselectivity of Oxidation Reactions Catalayzed by H64D/V68X Myoglobin"Biochemistry. 42. 10174-10181 (2003)
• [Publications] H.Sato, T.Hayashi, T.Ando, Y.Hisaeda, T.Ueno, Y.Watanabe: "Hybridization of Modified-Heme Reconstitition and Distal Histidine Mutation to Functionalize Sperm Whale Myoglobin"J.Am.Chem.Soc.. 126. 436-437 (2004)
• [Publications] T.Ueno, M.Suzuki, T.Goto, T.Matsumoto, K.Nagayama, Y.Watanabe: "Size Selective Olefin Hydrogenation by a Pd Nanocluster Provided in the Apo-Ferritin Cage"Angew.Chem.Int.Ed.. 43(印刷中). (2004)
• [Publications] T.Ueno, M.Ohashi, M.Kono, K.Kondo, A.Suzuki, T.Yamane, Y.Watanabe: "Crystal Structures of Artificial Metalloproteins"Inorg.Chem.. 43(印刷中). (2004)
• [Publications] Y.Watanabe, T.Ueno: "Introduction of P450, peroxidase, and catalase Activities into Myoglobin by Site-Dorected Mutagenesis : Diverse Reactivity of Compound I"Bull.Chem.Soc.Jpn. 76. 1309-1322 (2003)
• [Publications] 渡辺芳人: "P450の分子生物学(分担執筆)"講談社サイエンティフィク. 255 (2004)