2004 Fiscal Year Annual Research Report

自律複製する染色体外遺伝因子の細胞内動態と細胞外排出を支配する分子機構

Research Project

Project/Area Number	14340238
Research Institution	HIROSHIMA UNIVERSITY
Principal Investigator	清水典明広島大学, 総合科学部, 助教授 (10216096)
Keywords	染色体外遺伝因子 / 遺伝子増幅 / DM / HSR / 生細胞可視化技術 / 2本鎖切断 / DNA修復 / 細胞周期チェックポイント
Research Abstract	以下、主要な項目について、箇条書きする。1)DMの細胞内動態と排出に及ぼす2本鎖切断の影響;LacO配列をDM特異的に組み込み、それをLacR-GFPの発現により可視化することに成功した。そのような方法で可視化されたDMについて、γH2AXの局在を同調培養した細胞内で検討した。その結果、染色体外遺伝因子は2本鎖切断を受けた際の修復過程に関して染色体腕とは異なり、それが原因となって分裂期の分配異常、排出、に至るという重要な成果が得られた。2)DMやHSRの細胞内局在が、その遺伝子発現に与える影響;上記と同様な方法でDMやHSRをCFPで可視化したうえで、そこからMS2結合配列を持つRNAを誘導発現させ、それをMS2-YFPの発現で可視化することに成功した。この方法により、可視化されたHSRがどのような条件で転写可能となるか、DMが細胞内や微小核内でどのように発現するかを生細胞内で検討できるようになった。3)簡便で極めて効率の良い遺伝子増幅誘導系を用いた、有用蛋白質大量生産系の樹立;我々の開発した全く新規な遺伝子増幅法を用い、増幅した遺伝子から、そのコピー数に見合った量の発現を得る方法を樹立し、特許申請した。4)哺乳動物複製起点配列を持ち、安定に複製、分配されるプラスミドベクターの構築;プラスミド配列を安定化させるシス構造が具体的に明確になってきた。その法則を用いて、当初目的のベクター構築とその評価がいよいよ視野に入ってきた。5)長大で均質なHSRの特性を利用した、姉妹染色分体分離過程の解明:前年度までに行ったHSRの核内折り畳みと複製に関する研究は論文発表し、それをさらに発展させる研究を行った。6)微小注入されたDNA分子の細胞内動態と排出機構;前年度までに樹立した、生細胞内で注入DNA分子を追跡する実験系を用い、核内、細胞質内での動態と排出過程に関して理解を深め、成果をまとめて論文投稿した。