酵素電極反応インターフェイス分子の開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14350431
• Research Institution: Tokyo University of Agriculture and Technology
• Principal Investigator: 早出 広司 東京農工大学, 工学部, 教授 (10187883)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): FERRI Stefano 東京農工大学, 工学部, 助手 (90334474) ; 池袋 一典 東京農工大学, 工学部, 助教授 (70251494)
• Keywords: 酵素反応 / 触媒・化学プロセス / チトクローム / ナノバイオ / 電子伝達 / バイオエレクトロニクス / バイオセンサー

Research Abstract

本研究は、新たなバイオデバイス・プロセスを開発するためのインターフェイス蛋白質を開発することを目的とし、水溶性で大腸菌での組換え発現実績があるチトクロムb562(Cytb562)に着目している。本年度は特に、ターゲットとする酸化還元酵素との親和性を向上させることを目的とした。これまでに我々は、Cytb562が様々な酸化還元酵素の電子受容体として機能することを見出しているが、効率的な電子移動を達成するためには酵素に対してCytb562がモル比で100倍以上必要である。これは、天然電子受容体ではないCytb562を酵素反応の電子受容体としているからである。そこで、ターゲットとする酸化還元酵素にストレプトアビジンを結合させ、Cytb562にはストレプトアビジンと特異的に結合するビオチンを結合させることで効率的な電子移動を試みた。高発現ベクターpTrc99AのマルチクローニングサイトにCytb562構造遺伝子の終止コドンを除き、かつビオチンが結合するペプチド配列をコードする遺伝子を融合させた。これを大腸菌内で組換え発現させることによりビオチン化Cytb562を調製したところ野生型Cytb562と同一の酸化還元スペクトルを呈した。また、酸化還元酵素としてはPQQを補酵素とするグルコース脱水素酵素(PQQGDH)を用い、これにストレプトアビジンを架橋法により結合させたSvPQQGDHを構築した。SvPQQGDHをカーボンペースト電極に固定し、これをビオチン化Cytb562を含む緩衝液中でインキュベートすることでCytb562がPQQGDHと特異的な複合体を形成した酵素電極を構築した。この酵素電極は電子受容体を外部から加えることなくグルコースに対する良好な応答が観察され、かつ、用いるCytb562も低モル比でよいことから、新たな分子インターフェイスが構築できたものと評価した。

Research Products

• [Publications] Junko Okuda, Junko Wakai, Noriko Yuhashi, Koji Sode: "Glucose enzyme electrode using cytochrome b_<562> as electron me mediator"Biosensors and Bioelectronics. 18. 699-704 (2003)
• [Publications] Y.Nakazawa, T.Yamazaki, W.Tsugawa, K.Ikebukuro, Koji Sode: "Amperometric glucose sensor using thermnostable Co-factor binding glucose dehydrogenase"IEEJ Transactions on Sensors and Micromachines. 123(6). 185-189 (2003)
• [Publications] Akane Sakaguchi, Wakako Tsugawa, Stefano Ferri, Koji Sode: "Development of highly-sensitive fructosyl-valine enzyme sensor employing recombinant fructosyl amine oxidase"Electrochemistry. 71(6). 442-445 (2003)