植物の硝酸イオン輸送系タンパク質の翻訳後修飾に関する生化学的研究

2005 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14360039
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 末吉 邦 新潟大学, 自然科学系, 助教授 (10216278)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大山 卓爾 新潟大学, 自然科学系, 教授 (30152268) ; 大竹 憲邦 新潟大学, 自然科学系, 助手 (50313507)
• Keywords: 硝酸イオン / イオン輸送 / 翻訳後修飾 / トランスポーター / アニオンチャネル

Research Abstract

植物において培地からのNO_3^-吸収に関わる硝酸トランスポーター(HvNRT1およびHvNRT2)の翻訳後修飾に関する生化学的解析を加えることを目的に研究を行い,17年度は以下の結果を得た。
1.オオムギ根可溶性画分による細胞膜に結合したHvNRT2のin vitroリン酸化
発芽後、無窒素で7日間生育させたオオムギ幼植物に1mM硝酸カリウムを与え、24時間後に根よりミクロソーム画分と可溶性画分を調製した。調製したミクロソーム画分を可溶性画分とCa^<2+>および^<32>P-γ-ATP存在下でインキュベートした。反応後膜タンパク質を可溶化し、HvNRT2タンパク質を特異抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をSDSポリアクリルアミド電気泳動に供し、オートラジオグラフィーで解析した結果、分子量50 k Da付近にバンドが検出された。ミクロソーム画分タンパク質を抗HvNRT2抗体でウェスタンブロット解析した場合にも50 k Da付近にバンドが検出されることがすでに示されている。従って、本実験により、細胞膜に結合したHvNRT2が可溶性画分に含まれるリン酸化酵素によってリン酸化されたことが明らかになった。
2.オオムギ低親和性硝酸トランスポーター(HvNRT1)のcDNAクローニング
オオムギにおいては、高濃度領域(mMレベル)の硝酸吸収に機能するとされる低親和性硝酸トランスポーター(NRT1)遺伝子は単離されていなかった。まず、オオムギESTデータベース上に、イネNRT1(OsNRT1.1)と配列の似通ったESTクローンを見出し、その配列情報を元にオオムギ根由来全RNAから5'RACEおよび3'RACEを行い、オオムギNRT1の全長をカバーするHvNRT1.1を得た。この遺伝子は、根および葉で構成的に発現していることが明らかとなった。