2002 Fiscal Year Annual Research Report

触媒アミノ酸の変異により新しい機能を獲得したグリコシラーゼの研究

Research Project

Project/Area Number	14360043
Research Institution	Hokkaido University
Principal Investigator	木村淳夫北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (90186312)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	玖村朗人北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (00241365) 森春英北海道大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (80241363)
Keywords	糖転移 / グリコシダーゼ / 合成酵素
Research Abstract	グリコシラーゼは糖質のグリコシド結合を加水分解する酵素の総称である。これらの酵素は加水分解の他に、基質のグリコシド残基をアクセプターに転移する反応(糖転移反応)を示す。転移反応は応用性が高く、i)清涼飲料水などの食品に含まれる機能性オリゴ糖の生産やii)多彩な生理活性をもつ複合糖鎖の合成に利用されている。しかし、加水分解と糖転移反応は切り離すことはできず、同時に進行する。従って、転移糖の生成条件であっても基質の加水分解が行われ、かつ、転移反応の生成物も分解されてしまう。我々は、グリコシラーゼの構造と機能を解析してきた。この研究過程で糖転移反応のみを抽出できる現象を見出した。本課題の目的は、本現象の機構を分子解析し応用に結びつけることである。本年度の成果を以下に示す。 1)標的とするグリコシラーゼについて、自殺基質の手法で求核残基の推定に成功した。本残基の点置換酵素について、精製の迅速化のため(His)_6結合法を採用し、得られた酵素の性質に変化がないことを確認した。作製を計画した点置換酵素の数は多いが、遺伝子構築・発現・精製を精力的に行っている。2)歪み発生を行うアミノ酸残基を置換した変異酵素の作製を行い、精製に成功した。基本的性質を調べたところ、温度やpHに対する安定性が低下していることが分かったが、今後の実験には支障がないと判断された。3)本研究に必要なフルオライド基質について、合成法を確立できた。4)得られた合成酵素の機能解析(解離型の触媒アミノ酸の変異酵素)を進めている。至適pHがアルカリ側に移動する現象が生じており、別の酸性アミノ酸の関与が想像された。

Research Products
(6 results)

All Other

All Publications (6 results)

[Publications] K.Fukuda: "Identification of Essential Ionizable Groups and Evaluation of Subsite Affinities in the Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp."Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66・10. 2060-2067 (2002)
[Publications] K.Fukuda: "Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp."J. Appl. Glycosci.. 49・3. 265-272 (2002)
[Publications] T.Nishio: "Glycon Specificity Profiling of a-Glucosidase Using Monodeoxy and Mono-O-methyl Derivatives of p-Nitrophenyl α-D-Glucopyranoside"Carbohydr. Res.. 337・7. 629-634 (2002)
[Publications] H.Mori: "Barley α-Amylase Met53 Situated at the High-affinity Subsite-2 Belongs to a Substrate Binding Motif in the α→β Loop 2 of the Catalytic (β/α)_8-Barrel and Is Critical for Activity and Substrate Specificity"Eur. J. Biochem.. 269・22. 5377-5390 (2002)
[Publications] B.Svensson: "Fascinating Facets of Function and Structure of Amylolytic Enzymes of Glycoside Hydrolase Family 13"Biologia. 57・Suppl 11. 5-19 (2002)
[Publications] M.Son: "Evidence of Intramolecular Transglucosylation Catalyzed by an α-Glucosidase"J. Appl. Glycosci.. 50・1. 41-44 (2003)

2002 Fiscal Year Annual Research Report

触媒アミノ酸の変異により新しい機能を獲得したグリコシラーゼの研究

Principal Investigator

木村 淳夫 北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (90186312)

Research Products

[Publications] K.Fukuda: "Identification of Essential Ionizable Groups and Evaluation of Subsite Affinities in the Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp."Biosci. Biotechnol. Biochem.. 66・10. 2060-2067 (2002)

[Publications] K.Fukuda: "Kinetic Studies on Substrate Specificity and Active Site of β-D-Glucosidase F1 from Streptomyces sp."J. Appl. Glycosci.. 49・3. 265-272 (2002)

[Publications] T.Nishio: "Glycon Specificity Profiling of a-Glucosidase Using Monodeoxy and Mono-O-methyl Derivatives of p-Nitrophenyl α-D-Glucopyranoside"Carbohydr. Res.. 337・7. 629-634 (2002)

[Publications] H.Mori: "Barley α-Amylase Met53 Situated at the High-affinity Subsite-2 Belongs to a Substrate Binding Motif in the α→β Loop 2 of the Catalytic (β/α)_8-Barrel and Is Critical for Activity and Substrate Specificity"Eur. J. Biochem.. 269・22. 5377-5390 (2002)

[Publications] B.Svensson: "Fascinating Facets of Function and Structure of Amylolytic Enzymes of Glycoside Hydrolase Family 13"Biologia. 57・Suppl 11. 5-19 (2002)

[Publications] M.Son: "Evidence of Intramolecular Transglucosylation Catalyzed by an α-Glucosidase"J. Appl. Glycosci.. 50・1. 41-44 (2003)

木村淳夫北海道大学, 大学院・農学研究科, 教授 (90186312)