2002 Fiscal Year Annual Research Report
非プロテアーゼ系炭素-窒素結合切断酵素群の分子機能解析
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14360047
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
小林 達彦 筑波大学, 応用生物化学系, 教授 (70221976)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
東端 啓貴 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (20344864)
橋本 義輝 筑波大学, 応用生物化学系, 助手 (00323254)
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| Keywords | ニトリラーゼ / ニトリルヒドラターゼ / アミダーゼ / ニトリル / アシド / イソニトリルヒドラターゼ / イソニトリル |
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| Research Abstract |
非プロテアーゼ系炭素-窒素結合切断酵素群の中で、(他の酵素に関しては継続して研究を進めているが)現在、特にイソニトリルヒドラターゼに関して得られている成果について以下に記載する。
Pseudomonas属細菌のイソニトリルヒドラターゼを大量に精製し、阻害剤実験の効果を調べたところ、ヨード酢酸などのSH試薬と、セリン阻害剤であるPMSFによる阻害が確認された。このことから、システインあるいはセリンが反応機構に関わっている可能性が示唆された。また、構造遺伝子(inhA)から推定されるアミノ酸配列を相同性検索にかけた結果、アーキア由来の細胞内プロテアーゼと低いながらも相同性があることを発見した。このプロテアーゼは既に立体構造が明らかとなっており、反応に関与する活性中心アミノ酸残基も判明しているため、それらに相当するイソニトリルヒドラターゼのアミノ酸残基4カ所に対して部位特異的変異法によりアミノ酸置換を行った。それぞれの変異タンパク質用の発現ベクターを構築し、大腸菌を宿主として変異酵素を発現させた。最適条件下で大量に培養して得られた形質転換大腸菌体を超音波破砕処理し、無細胞抽出液を調製した。その後、陰イオン交換クロマトグラフィーなどのカラムクロマトグラフィーの操作を行うことによって、変異イソニトリルヒドラターゼをSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動上、単一になるまで単離精製した。これらの変異酵素のCDスペクトルならびに、Native分子量は、野生型酵素のものとほとんど同じであったことから、立体構造やサブユニット構成は野生型と同様であると考えられた。変異酵素のイソニトリルヒドラターゼ活性を測定した結果、101番目のシステイン残基をイソニトリルヒドラターゼ反応の活性中心アミノ酸残基であると同定した。
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[Publications] Goda, M.et al.: "Isonitrile hydrotase from Psundomonas putida N19-2"J.Biol.Chem.. 277. 45860-45865 (2002)
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[Publications] Hashimoto, Y.et al.: "Site directed mntagenesis for cysteine residues of cobalt-containing nitrile hydratase"J.Inorg.Biochem.. 91. 70-77 (2002)
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[Publications] Higashibata, H.et al.: "Helicase and endonuclease activities of hyperthermophile Pynococcus horikoshii Dua2 inhibited by substrates with RNA segnlents at 5'-end"J.Biol.Chem.. (印刷中). (2003)
