2002 Fiscal Year Annual Research Report
小腸コレステロール排出/胆汁酸吸収トランスポーターの機能解析と食品成分による調節
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14360069
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
佐藤 隆一郎 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 助教授 (50187259)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清水 誠 東京大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (30114507)
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| Keywords | コレステロール / 小腸 / 排出トランスポーター / LXR / Caco-2 |
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| Research Abstract |
動脈硬化症等の生活習慣病予防の一策として、小腸における脂質吸収を低下させ、脂質代謝を改善する試みが考えられる。小腸における脂質の吸収機構の実体は明らかでないが、近年、吸収とは逆向きの排出活性を担うトランスポーターが小腸上皮に同定され、取り込み・排出の差し引きとして吸収を捉える必要が生じてきた。本研究では、このような小腸における脂質、特にコレステロール排出の分子基盤を明らかにするために、コレステロール排出トランスポーターと想定されているABCA1に着目し、培養小腸細胞における機能発現解析を試みた。
(1)ヒトABCA1特異的抗体の作成
ヒトABCA1タンパク質アミノ酸79-427をHis-tagの後方に連結した融合タンパク質を大腸菌に発現させ、リコンビナントABCA1を調製した。これをウサギに免役し、抗血清を獲得した。同様にC末端側のペプチドを合成し、これに対する抗血清をウサギより得た。
(2)ヒト小腸上皮様細胞Caco-2を用いたABCA1発現調節実験
Caco-2細胞でのABCA1mRNA発現の確認をノザンブロット法を用いて行った。分化前後のCaco-2細胞から総RNAを抽出し、ABCA1発現変動について観察した。また、ABCA1は核内受容体LXRの応答遺伝子であることから、内因性リガンドと考えられている22(OH)コレステロール、あるいは合成リガンドを投与し、その発現誘導を解析した。
(3)CaCo-2細胞からのコレステロール排出評価系の構築
Caco-2細胞を透過性膜上に培養し、[3H]コレステロールを取り込ませた後、経時的に粘膜側、基底膜側に排出される放射性活性を測定した。LXRリガンドによりABCA1発現を亢進させた条件下での排出活性を追跡した。また、基底膜側への排出に関しては、HDL産生に不可欠なアポA-1を培地に添加して排出を評価した。
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