2002 Fiscal Year Annual Research Report
魚類ノダウイルスの遺伝子操作系の構築と病原メカニズムの解明
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14360110
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
中井 敏博 広島大学, 大学院・生物圏科学研究科, 教授 (60164117)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
三瀬 和之 京都大学, 大学院・農学研究科, 助教授 (90209776)
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| Keywords | ベータノダウイルス / ウイルス性神経壊死症 / トランスフェクション / in vitro転写系 / 外被タンパク質遺伝子 / ポリメラーゼ遺伝子 / SJNNV / 病原性 |
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| Research Abstract |
1.ウイルスRNAの感染系の確立
SJNNV(SJNag93株)およびRGNNV(RGWak97株)から抽出したRNA1(ポリメラーゼ遺伝子)およびRNA2(外被タンパク質遺伝子)を材料として、E-11細胞へのトランスフェクション(リポフェクション法)による感染系を確立した。トランスフェクションによる細胞への感染の確認は、ウサギ抗血清を用いた蛍光抗体法による抗原の検出および電子顕微鏡によるウイルス粒子の観察によりおこなった。
2.ウイルスRNAの末端の構造およぴ塩基配列の決定
SJNNV、RGNNVともに、それらの両RNAの5'端にキャップ構造が存在し、3'端ににはタンパク質様物の修飾構造が認められた。5'-RACEおよび3'-RACEによって得た産物を直接シークエンスして両端およびその近傍の塩基配列を決定した。両ウイルスの両ゲノムの5'端(UAA)および3'端(UCGCG)にはコンセンサス配列が認められた。
3.in vitro転写系の確立
決定した5'端と3'端部分の塩基配列に基づいてプライマーを作製し、各ウイルスのRNA1およびRNA2の完全長のcDNAを合成した。T7プロモーター配列を付加したプライマーを用いてPCRで増幅した後、プラスミドベクターに挿入して、大腸菌を形質転換させ、抽出したプラスミドからRNAポリメラーゼで転写産物を得た。得られた転写産物の感染性を上述のE-11細胞へのトランスフェクションにより確認した。細胞で産生されたウイルス粒子のシマアジ仔魚(SJNNV)およびマハタ仔魚への病原性を確認した。この機能性cDNAの全塩基配列を決定した。
4.SJNNV subgenomic RNA3の解析
SJNNV感染細胞から抽出したRNAに、RNA1に特異的なプローブにのみ反応するに低分子のRNAの存在が認められた。このRNAはウイルス粒子からは検出されなかったことから、昆虫ノダウイルスで知られているRNA3と考えられた。このRNA3の長さはは378塩基で、74個のアミノ酸からなるタンパク質(分子量:約8kDa)をコードすることが明らかになった。
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