オートファジー性神経細胞死の制御機構に関する分子細胞生物学的研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370005
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 内山 安男 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (10049091)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 亀高 諭 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (10303950) ; 大澤 良之 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (30273642) ; 和栗 聡 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (30244908) ; 柴田 昌宏 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (10343253)
• Keywords: オートファジ / リソソーム / カテプシンD / カテプシンB / ノックアウトマウス / インヒビター / 低酸素-脳虚血 / 海馬CA1錐体細胞

Research Abstract

低酸素-虚血負荷実験とカテプシンDのインヒビターの探索:
生後1週齢のカテプシンDおよびBをそれぞれ欠損するマウスとそれぞれのヘテロ、野生型の同腹仔を実験に用いた。片側の総頸動脈を結紮した後、37℃、8%酸素-92%窒素の条件下の容器に40分間放置することにより低酸素-虚血負荷をかけた。野生型マウスの海馬標本を用いて経時的に、カスパーゼ-3活性を、また、ゲノムDNAを電気泳動で検討した結果、カスパーゼ-3活性は負荷後3時間から6時間にかけ上昇し、24時間後には正常値に復した。DNAは24時間後にヌクレオソーム単位で切断されラダー形成が見られた。同マウスの凍結切片でみると、時間経過と共に海馬CA1領域にTUNEL陽性の細胞が増加し、負荷後1日から3日にその数はピークに達した。活性型カスパーゼ-3の染色では、負荷後1日から3日目では陰性であった。オートファジーのマーカーであるLC3の染色を行ったところ、TUNEL陽性の神経細胞では顆粒状に染まり、低酸素負荷によりオートファジーが誘導されることが分かった。また、カテプシンDも同細胞に染色性が顕著に増加した。負荷後3日目で見ると、33%の野生型マウスは、低酸素負荷でTUNEL陰性であったが、カテプシンD欠損マウスでは80%で陰性であった。カテプシンB欠損マウスでは多少陽性を呈するマウスの割り合いが増えていたが、対照群と有意差はなかった。これらの結果は、カテプシンDを欠損すると海馬CA1錐体細胞は低酸素-虚血負荷に耐性になることを示し、カテプシンDのインヒビターを開発することにより、脳虚血に対する新しい治療薬が期待できることを示唆している。
カテプシンDのタンパク質性インヒビターを放線菌より見い出し、そのDNAクローニングに成功した。現在、このタンパク質の活性特性を検討している。

Research Products

• [Publications] Kametaka S, Shibata M, Moroe K, Kanamori S, Ohsawa Y, Waguri S, Sims PJ, Emoto K, Umeda M, Uchiyama Y: "Identification of phospholipid scramblase 1 as a novel interacting molecule with β-secretase(β-site amyloid precursor protein(APP)processing enzyme(BACE))"J Biol Chem.. (in press).
• [Publications] Koike, M., Shibata, M., Ohsawa, Y., Nakanishi, H., Koga, T., Kametaka, S., Waguri, S., Momoi, T., Kominami, E., Peters, C., Figura, K.von, Saftig, S., Uchiyama, Y.: "Involvement of two different cell death pathways in retinal atrophy of cathepsin D-deficient mice"Mol. Cell. Neurosci.. (in press).
• [Publications] Shibata, M., Koike, M., Waguri, S., Zhang, G., Koga, T., Uchiyama, Y.: "Cathepsin D is specifically inhibited by deoxyribonucleic acids"FEBS Letters. 517. 281-284 (2002)
• [Publications] Waguri, S., Dewitte, F., Borgne, R., Rouille, Y., Uchiyama, Y., Dubremetz, J.F., Hoflack, B.: "Visualization of TGN to endosomes trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells"Mol. Biol. Cell. 14. 142-155 (2003)
• [Publications] Suzuki, H., Yanaka, A., Shibahara, T., Matsui, H., Nakahara, A., Tanaka, N., Muto, H., Momoi, T., Y.Uchiyama: "Ammonia-induced apoptosis is accelerated at higher pH in gastric surface mucous cells"Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 283. 986-995 (2002)
• [Publications] Kawane, K., Fukuyama, H., Yoshida, H., Nagase H., Ohsawa, Y., Uchiyama, Y., Nagaya, S.: "Impaired thymic development in mouse embryos deficient in apoptotic DNA degradation"Nature Immunology. 4. 138-144 (2003)