対物レンズ照射型エバネッセンス顕微鏡によるイオンチャネル動態の解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370010
• Research Institution: Hamamatsu University School of Medicine
• Principal Investigator: 寺川 進 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 教授 (50014246)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 櫻井 孝司 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助手 (50283362) ; 山本 清二 浜松医科大学, 光量子医学研究センター, 助教授 (60144094)
• Keywords: Kチャネル / ゲーティング / 電圧依存性 / エバネッセンス顕微鏡 / 膜電位固定実験 / 卵母細胞 / 一分子イメージング / 全反射照明

Research Abstract

広い領域に光照射して細胞膜上に反応する蛍光輝点を見出し、標本を動かしてその反応する輝点を顕微鏡視野中心に移動させてそこだけに励起光を狭めて、反応の時間経過を測定するという方法をとった。これによって、他の輝点の退色を防ぐことに成功した。しかし、チャネル活動に由来すると思われる蛍光輝度変化が高速(ミリ秒)の膜電圧変化に追随しないという特性があることが分かった。これは、次の可能性のいずれかを示唆している。輝点として見えるものがまだ単一の蛍光色素を代表していないこと(チャネルは4つのサブユニットからなるので可能性が高い)、色素が付いている電圧感受性セグメントの動きがデジタル的(本研究の結論となる?)ということ、膜電圧固定が観察している細胞膜の領域において不完全なものとなっている(修正は卵母細胞では困難)ということである。最終年度にこれらの可能性を判別し、最終結論を出す必要がある。これに加えて、HEK297細胞にてチャネルを発現させることを試みた 実験の段階には、RNAの注入、本来的に存在する膜上のシステインをポリグルタミンマレイマイドによりブロックする、Kチャネルを発現させる、それをテトラメチルロダミンマレイマイドにより修飾する、膜電位固定法により細胞膜に脱分極刺激を与える、蛍光強度変化を測定する、などがあり、各段階の効率を評価した。結果、発現したチャネルが細胞膜に移行する段階が最も困難な過程であった。すなわち、発現タンパクが細胞内に留まる傾向があった。これは、GFP化チャネルの振る舞いとも一致していた。この段階をカエルの卵母細胞のように効率よく進ませることが課題となった。

Research Products

• [Publications] Sakurai T.et al.: "Slit-scanning microscope with a high NA objective lens for analysis of synaptic function"Proc.SPIE (Soc.Photonic Industry & Engineering). (発表予定). (2004)
• [Publications] 寺川 進, 坪井貴司: "レーザートラッピング技術による生細胞の機能観察"レーザー研究. 31巻(6). 384-387 (2003)
• [Publications] 寺川 進 他: "エバネッセンス顕微鏡"生体の科学. 54巻(3). 245-253 (2003)
• [Publications] 寺川 進: "組織細胞化学会2003(新しい顕微鏡の技術:分担)"日本組織細胞化学会(学際企画). 109-114 (2003)