機能構造の解明による新しいHIVコレセプターの同定

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370099
• Research Institution: Gunma University
• Principal Investigator: 清水 宣明 群馬大学, 医学部, 講師 (70261831)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 田中 淳 群馬大学, 医学部, 教務員 (20321953) ; 星野 洪郎 群馬大学, 医学部, 教授 (00107434)
• Keywords: HIV / GPCR / コレセプター / 細胞指向性 / Envタンパク質

Research Abstract

後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因ウイルスであるヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)のコレセプターはG蛋白質共役レセプター(GPCR)である。我々はリガンド未同定GPCRのGPR1が、HIV-1の脳血管周細胞指向性決定コレセプターであることを見い出した。HIVの変異は蓄積を続けているため、未知のコレセプターが存在する可能性が高い。本研究では、GPR1を使って既知のコレセプターに共通するアミノ酸配列機能モチーフを同定し、新規コレセプターをの探索に繋げることを目的をした。
1.GPR1の点突然変異体の作製。GPR1のコレセプター機能にはアミノ末端細胞外突出領域が必須で、特にチロシン残基を含む領域が重要である。GPR1のアミノ末端配列に欠失や置換変異を系統的に導入して活性の変化を解析し、コレセプター活性に重要な領域を同定した。
2.GPCRの系統関係の解析。現在までに約700種類のGPCRの遺伝情報が報告されている。アミノ末端にアスパラギン酸-チロシン(DY)配列を持つGPCRや既知のコレセプターと近縁なGPCRは、コレセプターとして機能する可能性がある。ペプチドをリガンドとする全てのGPCRの系統関係を明らかにした。
3.コレセプター候補GPCRのクローニング。上記の解析から、CCR9B、CCR10、CCR11、D6、FML1、及びXCR1などのGPCRを新規コレセプター候補とした。RT(reverse transcription)-PCR法を用いて、様々なヒト培養細胞からコレセプター候補GPCRのcDNAを合成し、抗生物質ブラスティサイジン耐性遺伝子持った発現ベクターpCX-bsrにクローニングした。
4.GPR1変異体とGPCR発現細胞の樹立。GPR1の点突然変異遺伝子とコレセプター候補GPCRをレトロウイルス・ベクター法を用いてNP-2/CD4細胞に導入した後、抗生物質選択して安定発現細胞を樹立した。GPCR遺伝子を導入したNP-2/CD4細胞のHIV感受性を、間接蛍光抗体法と培養上清中の逆転写酵素活性測定法で評価し、いくつかのGPCRにコレセプター活性を見い出した。本研究最終年度は、これらの新規コレセプター活性を更に詳しく解析する。