遺伝子繰作によるロタウイルスの感染性粒子形成のための系の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370105
• Research Institution: Fujita Health University
• Principal Investigator: 谷口 孝喜 藤田保健衛生大学, 医学部, 教授 (40094213)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 前野 芳正 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (70131191) ; 守口 匡子 藤田保健衛生大学, 医学部, 助手 (60298528) ; 佐々木 潤 藤田保健衛生大学, 医学部, 講師 (70319268)
• Keywords: ロタウイルス / 人工感染粒子 / リバースジェネテックス / リアソートメント / トリプシン依存性 / キメラウイルス

Research Abstract

今年度は、さまざまな遺伝子を導入したプラスミドの調製、発現系、選択の系の確立に取り組んだ。
1.ヘルパーウイルスを用いた系:トリプシン非依存性のサルロタウイルスSA11-L2クローン由来のVP4遺伝子、VP7遺伝子に対応するmRNAの調製・増殖に必須でないNSP1遺伝子のORF領域にGFP遺伝子を導入したssRNAの調製、VP4遺伝子IRES遺伝子-GFP遺伝子、VP4遺伝子IRES遺伝子-GFP遺伝子、VP4遺伝子-IRES遺伝子-GFP遺伝子を挿入したプラスミドを調製し、トランスフェクトあるいはエレクトロポレートした。ヘルパーウイルスとして、トリプシン依存性のヒトロタウイルスKU株を感染し、ウイルス増殖能を検討した。
2.ヘルパーウイルスを用いない系:ニワトリ胎児細胞でのみ細胞変性を起こし、本実験に使用する293T細胞、MA-104細胞に細胞変性を起こさないワクチニアウイルスDIEの変異株DIsにT7ポリメラーゼ遺伝子を挿入したDIs-T7の大量調製を初代ニワトリ胎児細胞を用いて行った。インフルエンザウイルスのリバースジェネテックスの系を参考として、T7プロモーター-ロタウイルス遺伝子-D型肝炎リボザイム-T7ターミネーターのプラスミドをサルロタウイルスSA11-L2株の11本の遺伝子すべてについて調製した。さらに、ロタウイルスのRNAポリメラーゼ複合体であるVP1、VP2、VP3の発現プラスミドを調製し、トランスフェクトあるいはエレクトロポレートし、CPEの出現、プラーク産生の点から感染性粒子の産生を検索した。
現在のところ、ポジティーブな結果は得られていない。しかし、実験に供すべき拭料の調製はほぼ終了したので、今後、実験条件の細部にわたる検討、ノーザンブロッテング、免疫沈降反応およびウェスタンブロッテングによる発現蛋白質の検出を詳細に検討し、研究を進めたい。

Research Products

• [Publications] T.Sanekata et al.: "Detection of human group B rotavirus in Bangladesh"Journal of Clinical Microbiology. (In press). (2003)
• [Publications] J.Sasaki, K.Taniuuchi: "The 5'-end sequence of the genome of Aichi virus, a Picornavirus, contains an element Critical for viral RNA encapsidation"Journal of Virology. 77・6. 3542-3548 (2003)
• [Publications] Y.Pongsuwanna et al.: "Detection of a human rotavirus with G12 and P[9] specificity in Thailand"Journal of Clinical Microbiology. 40・4. 1390-1394 (2003)