NS5A蛋白によるHCV replicon増殖制御機構の解明およびその応用

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370175
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 榎本 信幸 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (20251530)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡辺 守 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (10175127) ; 坂本 直哉 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 助手 (10334418)
• Keywords: C型肝炎ウイルス / レプリコン・システム / interferon regulatory factor 1 / interferon sensitivity determining region / interferon regulatory factor 3 / 分子標的治療 / 抗ウイルス療法 / NS5A領域

Research Abstract

本研究は新たに開発されたC型肝炎ウイルス(HCV)増殖系であるHCV replicon増殖系を用いてHCV-NS5A蛋白によるHCV増殖制御機構を解析し、より有効なC型肝炎治療方法の基盤を確立するために行われ、今年度、次の成果を得た。1.HC-J4株から独自に構築したレプリコンにおいて、NS5A領域の特定のアミノ酸変異を有するクローンが高レベルのゲノム増殖を生じることを明かにした(J Viral Hepatitis 2004 in press)。2.キメラ・リポーター発現レプリコンを用いたウイルス増殖定量システムを構築し、インターフェロン、リバビリン等の薬剤を用いたウイルス増殖抑制効果の定量的解析の結果を報告した(J Infect Dis2004 in press)。3.宿主遺伝子を特異的に破壊するsmall interfering RNA(siRNA)の効果を解析するためHCVゲノムを標的とするsiRNAを構築し、レプリコン発現細胞に導入したところ、強い遺伝子破壊効果(最大96%)が認められた。さらに、細胞内でヘアピン型siRNAを発現するDNAプラスミドベクターを構築し抑制効果を確認した。4.インターフェロン誘導遺伝子の発現を制御するinterferon regulatory factor (IRF)1及びIRF-3を遺伝子導入することにより、レプリコン増殖が著明に抑制された。またIRF-3をsiRNAにより抑制したところHCV増殖が上昇し、細胞内においてIRFの機能がウイルス持続感染増殖に密接に関与することを見いだした(論文投稿中)。
本研究により同定される分子群はいずれもHCV研究あるいは治療開発の新しい分野への展開が期待できるものであり、今後さらにウイルス増殖に関与する宿主蛋白の同定、抗ウイルス療法の新たな標的分子の探索を遂行して行く。

Research Products

• [Publications] Sakamoto N, Yokota T, et al.: "Inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by synthetic and vector-derived siRNAs"EMBO Roports. 4. 602-608 (2003)
• [Publications] Miyasaka Y, Sakamoto N, et al.: "Hepatitis C virus NS5A protein inhibits TNF-alpha mediated apoptosis in HUH7 Cells"J Infect Dis. 188. 1537-1544 (2003)
• [Publications] Maekawa S, Sakamoto N, et al.: "Introduction of NS5A Mutations Enables Subgenomic HCV-Replicon Derived from Chmpanzee-Infectious HC-J4 Isolate to Replicate Efficiently in Huh-7 Cells"J Viral Hepatitis. in press. (2004)
• [Publications] Sakamoto N, et al.: "Synergistic inhibition of intracellular hepatitis C virus replication by combination of ribavirin and interferon-alpha"J Infect Dis. in press. (2004)
• [Publications] Sakamoto N. et al.: "Specific inhibition of hepatitis C virus replication by cyclosporin A"Biochem Biophys Res Com. 313. 42-47 (2004)