リアルタイムイメージング法による表皮細胞間接着分子の機能解析

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370262
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 西川 武二 慶應義塾大学, 医学部, 教授 (50051579)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 石河 晃 慶應義塾大学, 医学部, 専任講師 (10202988) ; 天谷 雅行 慶應義塾大学, 医学部, 専任講師 (90212563) ; 田中 勝 慶應義塾大学, 医学部, 助教授 (40188339) ; 高江 雄二郎 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (00306367) ; 永尾 圭介 慶應義塾大学, 医学部, 助手 (40286521)
• Keywords: 細胞接着 / デスモグレイン / カドヘリン / ケラチン / 天疱瘡 / 自己抗体 / アデノウイルス / 細胞骨格

Research Abstract

本研究の目的は、蛍光蛋白質を用いて、表皮細胞間接着において重要な役割をするデスモゾーム関連蛋白のリアルタイムイメージング法を開発し、細胞間接着におけるそれぞれの蛋白の空間的情報(細胞内局在)及び時間的情報(経時変化)を解析し、全く新しい観点からデスモゾーム関連蛋白の機能解析を行うことである。本年度は、ケラチン14と緑色蛍光たんぱく質EGFPとのキメラ蛋白K14-GFPをアデノウイルスに挿入し、正常ヒト初代培養表皮細胞に感染させて、ケラチンネットワークのリアルタイムでの可視化にデルタビジョンを用いて成功した。さらに、水疱形成能を有する病的な抗Dsg3マウスモノクローナル抗体AK23添加後に、ケラチンの接着面へのinsertionがなくなり、いわゆるkeratin retractionが起こることが観察された。しかし、初代培養表皮細胞は、A431などの癌細胞由来細胞株に比し細胞の高さが高いため、細胞間接着面へのフォーカスを常に合わせておくことができず、長時間の観察が困難であることが問題である。次年度には、細胞膜蛋白であるデスモグレイン3,デスモコリン3、あるいは裏打ち蛋白であるプラコグロビンなどと赤色蛍光たんぱく質(mRFP)とのキメラ蛋白の組換えアデノウイルスを作成し、ケラチンと同時にデスモゾーム構成蛋白を可視化することにより、包括的にデスモゾームの動態を解析できるよう準備を整えている。さらに、カルシウムシフトによりデスモゾームが形成される際の、デスモゾーム関連分子の動態、水疱形成を誘導することのできる病的抗Dsg3モノクローナル抗体と水疱形成を誘導しない抗Dsg3モノクローナル抗体のデスモゾーム構成蛋白に及ぼす影響の差につき、詳細に検討する。

Research Products

• [Publications] Ota T, Amagai M, Watanabe M, Nishikawa T: "No involvement of IgG autoantibodies against extracellular domains of desmoglein 2 in paraneoplastic pemphigus or inflammatory bowel diseases."J Dermatol Sci. 32. 137-141 (2003)
• [Publications] Ohyama M, Ota T, Aoki M, Tsunoda K, Harada R, Koyasu S, Nishikawa T, Amagai M.: "Suppression of the immune response against exogenous desmoglein 3 in desmoglein 3 knockout mice : An implication for gene therapy"J Invest Dermatol. 120. 610-615 (2003)
• [Publications] Futei Y, Amagai M, Hashimoto T., Nishikawa T: "Conformational epitope mapping and IgG subclass distribution of desmoglein 3 in paraneoplastic pemphigus"J Am Acad Dermatol. 49. 1023-1028 (2003)
• [Publications] Nishifuji K, Amagai M, Ota T, Nishikawa T, Iwasaki T: "Cloning of canine desmoglein 3 and immunoreactivity of serum antibodies in human and canine pemphigus vulgaris with its extracellular domains."J Dermatol Sci. 32. 181-191 (2003)
• [Publications] Shimizu A, Ishiko A, Ota T, Tsunoda K, Amagai M, Nishikawa T: "IgG binds to desmoglein 3 in desmosomes and causes a desmosomal split without keratin retraction in a pemphigus mouse model."J Invest Dermatol. (in press). (2004)
• [Publications] Aoki-Ota M, Tsunoda K, Ota T, Iwasaki T, Koyasu S, Amagai M, Nishikawa T: "A mouse model of pemphigus vulgaris by adoptive transfer of naive splenocytes from desmoglein 3 knockout mice."Br J Dermatol. (in press). (2004)