細胞内膜系CLCクロライドチャネルの生体での役割に関する研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370316
• Research Institution: Tokyo Medical and Dental University
• Principal Investigator: 内田 信一 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (50262184)
• Keywords: CLCクロライドチャネル / エンドソーム / ライソゾーム / neuronal ceroid lipofuscinosis / ノックアウトマウス / トランスジェニックマウス / F1F0-ATPase / Iysosomal storage disease

Research Abstract

1)CLC-3ノックアウトマウスの解析を行い報告した。CLC-3ノックアウトマウスはホモ変異体でも生存したが、明らかに成長が野生型に比して悪く、出生後の死亡率も高かった。さらに失調、神経細胞の脱落、網膜視細胞の脱落などの症状から、ヒトNeuronal ceroid lipofuscinosis (NCL)モデルであるかを確認するため、電子顕微鏡的にライソゾーム内に蓄積物質が存在するか否か、またNCLの、疎水性に富んだF1F0-ATPase subunitCが細胞内に蓄積することがいわれているので、その蓄積を免疫染色、細胞を分画後のウエスタンブロットにて検討した。この結果、細胞内にelectron denseなdepositを認め、subunit Cの蓄積も確認されCLC-3ノックアウトマウスはヒトNCLモデルであることが確定した。
2)次に、なぜCLC-3クロライドチャネルの異常がNCLに結びつくのかを探るため、CLC-3が存在する細胞内膜系の膜内のpHを測定した。In vivoではFITC-dextranをマウスの腹腔内に注射し、肝臓組織よりベジクルを生成し、蛍光により膜内のpHを測定した。この結果、ノックアウトマウスでは有意に高い膜内pHを認め、CLC-3が後期エンドソームないしライソゾームでpH環境維持に関与していることが示され、そのpH上昇が、ライソーゾーム酵素の活性を阻害し、いわゆるIysosomal storage diseaseを引き起こすのではないかと考えられた。
3)CLC-3,5とノックアウトマウスは作成されたが、同じファミリーに属するCLC-4のノックアウトマウスは報告がない。今回、ターゲティングベクターの作成を終了し、ES細胞の組み替え体を200クローンスクリーニングし、1ケ組み替え体をえた。キメラマウス作成中である。その他、膵ベータ細胞でのインスリン分泌にCLC-3の関与を報告する文献が存在したため、単離膵島細胞にてインスリン分泌能を検査したが、CLC-3ノックアウトで変化は見られなかった。

Research Products

• [Publications] Hirofumi Maehara: "Expression of CLC-kB gene promoter in the mouse cochlea."NeuroReport. 14. 1571-1573 (2003)
• [Publications] Atsushi Hayama: "Molecular mechanisms of Bartter syndrome caused by mutations in the BSND gene."Histochem Cell Biol. 119. 485-493 (2003)
• [Publications] Teiko Ohashi: "Intracellular mislocalization of mutant podocin and correction by chemical chaperones."Histochem Cell Biol. 119. 257-264 (2003)