2004 Fiscal Year Annual Research Report
軟骨・非軟骨細胞におけるコラーゲン分子の発現機構及び分子ドメインの機能解析
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14370468
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| Research Institution | Oita University |
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Principal Investigator |
吉岡 秀克 大分大学, 医学部, 教授 (00222430)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
住吉 秀明 大分大学, 医学部, 助手 (60343357)
調 恒明 大分大学, 医学部, 助教授 (50179058)
二宮 善文 岡山大学, 医学部, 教授 (70126241)
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| Keywords | コラーゲン / 転写調節 / CBF / NF-Y / 骨 / 細胞外マトリックス / V型コラーゲン / III型コラーゲン |
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| Research Abstract |
1.V型collagen α3鎖遺伝子の転写調節及び骨組織における発現
ルシフェラーゼアッセイを行い転写開始点より129bp上流までがヒトα3(V)鎖遺伝子のコアプロモーターであると推測された。この領域のDNA結合因子を調べるためにDNaseIフットプリンティングおよびゲルシフトアッセイを行った。-160〜-51bpに4箇所の核タンパクが結合する領域(上流よりA、B、C、D)が存在した。変異プロモーターを用いてその活性を検討したところ、タンパク結合領域Aには転写活性化因子が、タンパク結合領域B、Cには転写抑制因子が結合すると推測された。タンパク結合領域AにはCCAAT配列が存在しており、Competitionアッセイ、SupershiftアッセイおよびCHIPアッセイを行い、同領域にCBF/NF-Yが結合していることを証明した。さらにCBF-Bの変異型を過剰発現させたところプロモーター活性は有意に低下した。
マウス胎児においてその転写産物及びタンパクの分布を調べた。in situ hybridization法によりその転写産物は発生中の筋組織や腱組織或いは一部の骨形成が行われている組織に見られた。さらにα3(V)鎖に対する特異的なモノクロナール抗体を作製しそのタンパクの分布をみると、主に骨形成中の組織に染色が見られた。
2.III型collagen α1鎖遺伝子の転写調節
マウス遺伝子の研究により転写開始点上流-83〜-61bpに転写に最も重要なDNA結合蛋白質(BBF)が結合することがわかっている。この領域についてルシフェラーゼアッセイやゲルシフトアッセイを用いて詳細に解析した結果、BBFを中心に複合体が形成されること、また複合体を構成するタンパク質には細胞系の違いによってバリエーションがあることがわかった。
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