減数分裂可能な細胞株を用いた精子形成細胞の増殖・分化機構の解析とその臨床的意義

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370511
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 藤田 潤 京都大学, 医学研究科, 教授 (50173430)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 西山 博之 京都大学, 医学研究科, 助手 (20324642) ; 伊藤 克彦 京都大学, 医学研究科, 講師 (90281097)
• Keywords: 減数分裂 / 精子 / 培養細胞 / モノクローナル抗体 / 免疫組織染色

Research Abstract

マウス精母細胞株GC-2spd(ts)に由来する、減数分裂を起こすクローンGC-2M細胞を利用して、以下の成果を得た。
1.GC-2M細胞における減数分裂の解析
GC-2Mを32度で培養してRNAを抽出し、RT-PCR法により、精子形成細胞の分化に応じて通常発現している遺伝子、cot-4,rad21,rad51,rec8,SCP-3,Dmc1等の発現状態を解析したが、rad21が発現検出できたのみで、他は検出できなかった。GC-2Mが減数分裂時に対合を行っているかどうか、相同染色体の対合状態を顕微鏡さ観察すると共に、免疫染色にて確認する予定である。なお、レトロウイルス感染により1n細胞のマーキングを試みている。
2.GC-2M細胞の表面蛋白に対する抗体の作製
(1)GC-2M細胞を大量培養し、その膜分画を精製し、抗原としで雌マウスを免疫し、ハイブリドーマを作製した。約300クローンの培養上清でマウス精巣の凍結切片を染色して、精子形成細胞を染色するモノクローナル抗体を選び、抗体の特異性、安定性等から3クローンを主に解析中である。GC-2M細胞を染色するが、GC-2N細胞(減数分裂を行わないGC-2spd(ts)由来クローン)は染色しない抗体は認められなかった。
(2)10種類のモノクローナル抗体について、GC-2M細胞の増殖に対する影響を解析したが、影響は見られなかった。マウス生体内での効果を一部検討中である。
3.GC-2M細胞で減数分裂特異的に発現する遺伝子の検索
GC-2M細胞において、正常精巣温度(32度)特異的に発現する遺伝子を、8、500遺伝子のマイクロアレイで検索した。37度に比べ発現量に2倍以上の差があるものについて、ノーザン解析で確認中である。

Research Products

• [Publications] Nagao, T.: "MAGE-A4 interacts with the liver oncoprotein gankyrin and suppresses its tumorigenic activity"J. Biol. Chem.. (印刷中). (2003)
• [Publications] Higashitsuji, H.: "A novel protein over expressed in hepatoma accelerates export of NF-KB from the nucleus and inhibits p53-dependent apoptosis"Cancer Cell. 2. 333-346 (2002)
• [Publications] Dawson, S: "Gankyrin : an Ankyrin-repeat Oncoprotein interacts with CDK4 Kinase and the S6 ATPase of the 26 S proteasome"J. Biol. Chem.. 277. 10893-10902 (2002)
• [Publications] Ohnishi, N.: "High expression of transgenes mediated by hybrid retroviral vectors in hepatocytesi comparison of promoters from munine retroviruses in vitro and in vivo"Gene Ther.. 9. 303-306 (2002)