2004 Fiscal Year Annual Research Report
頭頸部癌細胞由来α-N-アセチルガラクトサミニダーゼのクローニングと機能解析
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14370683
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
上松 隆司 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 助教授 (40203476)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
古澤 清文 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 教授 (90165481)
高橋 昌宏 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (90340059)
堂東 亮輔 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (40329470)
松浦 隆 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (10298408)
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| Keywords | 頭頸部癌 / α-N-アセチルガラクトサミニダーゼ / クローニング |
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| Research Abstract |
【目的】本年度の研究では、分離された頭頸部癌培養細胞から抽出したα-N-acetyl galactosaminidase活性を示す蛋白に対するポリクローナル抗体を作成し、遺伝子クローニングを行った。
【方法】1)頭頸部癌培養細胞から抽出したα-N-acetylgalactosaminidase活性を示す蛋白を抗原とし、ラビットを宿主としてポリクローナル抗体を作製した。
2)頭頸部癌のHela細胞より抽出したmRNAを抽出し、1^<st> strand cDNAを調製後、Hela細胞より抽出したUNIZAPXR VECTORに挿入してcDNAベクターライブラリーを作製した。ファージベクターのホストとしてXL-1 Blueを用いた。
3)XL-1 Blueを用いてファージタイターを測定したところ、2.4×10^<12> Pfu/mlであった。
4)IPTGを添加したNZY平板培地に、ファージを吸着させたXL-1 Blueをまき、42℃の温度シフト後に形成されたプラークをブロッティング膜に転写させた。作製したポリクローナル抗体を用いてECL法によってクローンを検出した。
5)クローンは、ヘルパーファージを用いてファージミドとし、塩基配列をギルバート法で決定した。
【結果】Hela細胞より抽出した、約2500塩基のリーディングフレームを持つ新規mRNAをクローニングした。本蛋白は、DEVD Boxを有し、N末端側に塩基性アミノ酸配列と核移行シグナルが、またC末端側には回文構造がみられた。NCBIのBlastnによる解析では、RNAヘリカーゼ様構造を持つとともに、α-ガラクトシダーゼやグルクロニダーゼとの相同性もみられ、糖鎖構造を脱糖鎖する機能を有すると考えられた。
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