歯周病の遺伝子治療 -局所的遺伝子導入による生体反応の制御-

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370710
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 高柴 正悟 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (50226768)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 久保田 聡 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (90221936) ; 西村 英紀 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (80208222) ; 窪木 拓男 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助教授 (00225195) ; 明貝 文夫 岡山大学, 大学院・医歯学総合研究科, 助手 (50263588)
• Keywords: 局所的遺伝子療法 / ラット唾液腺 / β-ガラクトシダーゼ / 細胞障害性 / ケミカルトランスフェクション法

Research Abstract

ラット唾液腺に発現させたβ-Galの発現効率と細胞障害性に関する研究
近年,癌などの疾患に対してベクターを用いた遺伝子治療が応用されつつある。歯周疾患に対しても,歯周組織の感染を防御するタンパク因子の遺伝子を唾液腺の細胞に導入して,定常的に口腔内に供給し,歯周組織の再生を人為的に促進するという局所的遺伝子治療が可能になるかもしれない。本研究は,生体の防御能力を高めることを念頭に置いた歯周疾患の局所的遺伝子治療の開発を目的としたものである。その第一段階としてβ-ガラクトシダーゼ(β-Gal)を発現する遺伝子(lacZ)を用いることで,ラットの唾液腺細胞への外来遺伝子の導入を検討した。
【材料と方法】
1.β-Gal発現プラスミドベクターpRc/CMV-β-galの構築
発現ベクターpRc/CMVにlacZ遺伝子を組み込みpRc/CMV-β-galを得た。
2.β-galの導入
pRc/CMV-β-galの唾液腺への導入は,ウイスター系雄性ラットの唾液腺主導管から行った。遺伝子導入は,直接DNAのみを導入するダイレクトインジェクション法,エレクトロポレーション法,ケミカルトランスフェクション法を行った。I
3.遺伝子導入による細胞障害性
pRc/CMV-β-galを導入した2日後に唾液腺を摘出し,液体窒素存在下で凍結保存した。凍結標本を作製し,顕微鏡下で観察し組織障害性を観察した。
4.β-Galの発現とその検出
β-Galの発現部位は,上記3で作成した切片を用いβ-Gal染色キットでX-gal染色を行って調べた。
【結果および考察】
1.エレクトロポレーション法において8パルス,50ms,矩形波の条件において電圧が50mV,70mVでは細胞障害性はなかったが,100mVでは組織に上皮から真皮に及ぶ細胞障害を確認した。
2.β-galをラット唾液腺に導入し,β-Galの発現を確認した。しかし,遺伝子発現による組織に対する障害は確認しなかった。上記三種類の遺伝子導入法のうち,ケミカルトランスフェクション法のβ-Gal発現量は他2方法に比べ約2"3倍であった。
このことは,ケミカルトランスフェクション法が最も効率よくラット唾液腺細胞への外来遺伝子の導入を可能にすることを示唆している。

Research Products

• [Publications] 峯柴淳二, 塩見信行, 峯柴 史, 松浦香織, 新井英雄, 西村英紀, 村山洋二, 高柴正悟: "唾液腺細胞への外来遺伝子の導入に関する実験的研究"日本歯周病学会会誌,秋季特別号. 44. 88 (2002)