生体防御応答系の受容体蛋白質の三次元構造ベース創薬に向けた構造生物学展開

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14370727
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 佐藤 能雅 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 教授 (30150014)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 水谷 隆太 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (70272482) ; 野口 修治 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助手 (60237823)
• Keywords: リソソーム病 / 抗体 / 受容体 / X線結晶構造解析 / 構造生物学 / 三次元構造 / 自然免疫 / Toll-Like受容体

Research Abstract

生体での防御と応答に関わる受容体などの蛋白質の三次元構造の詳細を,X線回折結晶学を用いる構造生物学的アプローチによって,原子レベルで解明することを研究の目的とする。そのため,試料を大量に調製して結晶化し,構造情報を得て,医薬品のデザイン創製への展開を図った。
3年次計画の初年度として,各蛋白質の遺伝子を組み込んだ細胞を大量に培養し,蛋白質を分離,精製した。膜蛋白質の結晶化のための可溶化と,結晶析出の妨げとなる糖鎖の均一化などにより,高純度の結晶化用のサンプルを調製した。このような手法を用いて,まず,腎臓の膜にアンカーするヒトのジペプチダーゼのX線解析を完結した。この結晶は,糖蛋白質ジペプチダーゼとその阻害剤薬物であるシラスタチンの複合体であり,基質認識と阻害機構を解明できた。
細胞膜表面に存在するインターロイキン6(IL-6)と結合するIL-6受容体について,発現させたIL-6と受容体を精製して複合体を調製し,結晶化を進めた。複合体と思われる結晶を最近得ることができた。細胞膜貫通型ヒトアドレナリン受容体についても大量調製のための手順を種々試みた。
外来異物などを認識して生体の防御を担う免疫系の蛋白質では,獲得免疫系の抗体として紫外線損傷DNAを特異的に認識する抗体を2種類採り上げ,その抗原結合部位Fabフラグメントと損傷DNAとの複合体の結晶を得てX線解析を行った。DNAのホーミングエンドヌクレアーゼ,黄色ブドウ球菌由来リコンビナーゼ,リソソーム酵素のヒトα-ガラクトシダーゼの変異体,α-ガラクトサミニダーゼ,β-ガラクトシダーゼについても発現,精製,結晶化とX線解析を進めた。
自然免疫系のTLR(Toll-like receptor)受容体に関連するMD-2とMD-1の双方の蛋白質について発現系の構築を行い,前者については高発現株を調製することができた。

Research Products

• [Publications] Y.Nitanai, Y.Satow, H.Adachi, M.Tsujimoto: "Crystal Structure of Human Renal Dipeptidase Involved in β-Lactam Hydrolysis"J. Mol. Biol.. 321. 177-184 (2002)
• [Publications] R.Mizutani, S.Nogami, M.Kawasaki, Y Ohya, Y.Anraku, Y.Satow: "Protein-Splicing Reaction via a Thiazolidine Intermediate : Crystal Structure of the VMA1-Derived Endonuclease Bearing the N and C-Terminal Propeptides"J. Mol. Biol.. 316. 917-927 (2002)
• [Publications] R.Mizutani, T.Tsuchida, H.Yuzawa, T.Ito, K.Hiramatsu, Y.Satow: "Expression, Purification, and DNA-Binding Assay of a Staphylococcal Cassette Chromosome Recombinase CcrA"The 6^<th> Interncational Symposium Staphylococcal and on Staphylococci Infections. 99 (2002)
• [Publications] T.Kimura, R.Mizutani, Y.Satow, Y.Komatsu, E.Ohtsuka, O.Nikaido: "Crystal Structures of the TDM-2 Antibody Fab Fragment in Comlex with cis-syn Cyclobutane Thymidime Nucleotides"Acta Crystallographica. A58S. C257 (2002)
• [Publications] H.Yokoyama, T.Kimura, R.Mizutani, Y.Satow: "Crystallographic Studies on the Structures of Antibody Fab Fragments Complexed with Photodamaged DNA Molecules"SPring-8 Experiment Report. 9. 237 (2002)
• [Publications] Y, Osawa, R.Mizutani, Y.Satow: "Three-Dimensional Structural Studies on the Human α-Galactosidase Enzyme and Its Mutants Responsible for Fabry Disease"SPring-8 Experiment Report. 9. 238 (2002)