有用物質生産系開発を指向したトリテルペンの生合成工学

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380285
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 渋谷 雅明 東京大学, 大学院・薬学系研究科, 助教授 (50170923)
• Keywords: トリテルペン合成酵素 / オタネニンジン / ダンマレンジオール / カボチャ / ククルビタジエノール / セイヨウタンポポ / タラキセロール / グレープフルーツ

Research Abstract

1.トリテルペン生産植物からのトリテルペン合成酵素のクローニング
オタネニンジンからβ-アミリン合成酵素のクローニングの際に用いたプライマーを用いて、PCRにより、他の骨格を形成するトリテルペン合成酵素のクローニングを試みた。その結果、薬用ニンジン毛状根よりダンマレンジオイル合成酵素、カボチャ芽生えよりククルビタジエノール合成酵素、シラカンバ培養細胞よりルペオール合成酵素、セイヨウタンポポよりタラキセロール合成酵素、グレープフルーツより多機能性トリテルペン合成酵素のクローニングに成功した。
2.トリテルペン生産植物からの水酸化酵素、及び、配糖化酵素のクローニング
ソヤサポニンを生産するダイズのESTクローンを利用してトリテルペンの水酸化酵素をクローニングすることにした。まず、機能同定のための発現系の構築を行った。チトクロームP450の発現はこれまで一般に酵母が用いられている。そこで、酵母発現ベクターpYES2と酵母INVSC2株を使用することにした。まず、機能が同定されているケイヒ酸水酸化酵素(Cinnamate 4-hydroxylase, (C4H))を発現させ、発現系を構築することにした。報告されているダイズのC4Hの配列を利用して、ダイズの芽生え由来のRNAから逆転写したcDNAを鋳型にPCRで、ダイズC4HのORFを増幅した。このものをpYES2に組み込み、酵母INVSC2株を形質転換した。形質転換酵母の培養にケイヒ酸を投与し、細胞を収穫した。細胞を酢酸エチルで抽出し生成物をHPLCで調べたところ、生成物としてクマル酸を検出することができた。また、細胞を破砕し、粗酵素面分を調製し、ケイヒ酸を基質にin vitroの酵素活性を調べたところ、クマル酸への変換が確認された。以上の結果から、チトクロームP450型の発現系が構築されたと判断した。

Research Products

• [Publications] 渋谷雅明, 海老塚豊: "高等植物におけるトリテルペンの生合成:非天然型トリテルペン骨格創出への挑戦"有機合成化学協会誌. 60. 195-205 (2002)
• [Publications] 渋谷雅明, 海老塚豊: "非天然型トリテルペン生産への挑戦"バイオサイエンス. 60. 34-35 (2002)