新奇な膜形成に働くタンパク活性化酵素およびタンパク結合酵素の役割

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380308
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 上野 隆 順天堂大学, 医学部, 助教授 (10053373)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武野 大策 順天堂大学, 医学部, 助手 (00146771) ; 谷田 以誠 順天堂大学, 医学部, 講師 (30296868)
• Keywords: オートファジー / リソソーム / メラノソーム / ファゴソーム / タンパク活性化酵素 / タンパク結合酵素 / 膜形成 / オルガネラ

Research Abstract

1.メラノーマとマクロファージに発現するApg8ホモログの細胞内分布
Apg8は、酵母のオートファジーにおいて、リン脂質と結合しオートファゴソーム膜にターゲットされるタンパクとして同定され、オートファジーに必須なタンパクである。動物では、MAP-LC3、GABARAP、GATE-16の3つのホモログが存在するが、これらのホモログを高発現しているメラノーマ(B16-F1)とマクロファージ(J774.1)での細胞内分布を調べた。いずれのホモログも、リン脂質と結合し膜に局在するII型は、細胞のtotal lysateを17,000×gで遠心した沈澱(P17)に多かった。この分画は、リソソームやミトコンドリアに富む。さらに蛍光抗体法による解析により、メラノーマ細胞では、MAP-LC3とGABARAPは必ずしも分布は一致せず、前者は、メラノソームマーカーのTRP-1と良く共局在することが判った。また、J774.1ではラテックスビーズを貪食させたときのファゴソームに一部重なる像が得られ、ホモログとファゴソーム膜との関係についてさらに追析中である。
2.メラノソームのターンオーバーとホモログの役割
メラノーマのP17分画をOptiPrepの不連続密度勾配によってさらに分離し、GABARAP、GATE-16、MAP-LC3のそれぞれは、部分的に共通の分布を示すが完全には重ならないことを確認した。また、予めリソソームのカテプシン阻害剤存在下に培養した細胞から得られたP17の場合は、ホモログが密度の大きい顆粒領域に濃縮され、他のメラノソームマーカーとも共通の分布を示すようになることが判った。
このことは、メラノソームがリソソーム経由で速い分解を受け、この分解にホモログが関与することを示しているが、このような分解は培地の栄養条件とは関係なく起こり、オートファジーとは異なる現象であることが解った。

Research Products

• [Publications] Isei Tanida: "Mammalian Apg12p, but not the Apg12p・Apg5p conjugate, fascilitates LC3 processing"Biochemical Biophysical Research Commun.. 296. 7 (2002)
• [Publications] Isei Tanida: "Murine Apg12p has a substrate preference for murine Apg7p over three Apg8p homologues"Biochemical Biophysical Research Communications. 292. 7 (2002)
• [Publications] Isei Tanida: "Human Apg3p/Aut1p homologue is an authentic E2 enzyme for multiple substrates, Gate-16, GABARAP, ・・・・"Journal of Biological Chemistry. 277. 6 (2002)