新奇な膜形成に働くタンパク活性化酵素及びタンパク結合酵素の役割

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380308
• Research Institution: JUNTENDO UNIVERSITY
• Principal Investigator: 上野 隆 順天堂大学, 医学部, 助教授 (10053373)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 武野 大策 順天堂大学, 医学部, 助手 (00146771) ; 谷田 以誠 順天堂大学, 医学部, 講師 (30296868)
• Keywords: オートファジー / リソソーム / メラノソーム / ファゴソーム / タンパク活性化酵素 / タンパク結合酵素 / 膜形成 / オルガネラ

Research Abstract

平成15年度に提案した2つの研究計画を中心に以下報告する。
1.メラノソームへのMAP-LC3とGABARAPの局在
メラニン形成ホルモンやIBMX(isobutylmethylxanthine)で刺激したB16-F1メラノーマを培養すると、突起を多く出した形態に変化し、オートファゴソームマーカーのLC3がメラノソームマーカーであるチロシナーゼやTRP-1と共局在しながら、細胞の表層近くに多く分布するのを観測した。LC3はApg7とApg3による2段階の酵素反応を受けてリン脂質と結合し、オートファゴソーム膜に動員されることが解っているので、同じ酵素システムの働きでLC3がメラノソーム膜に動員されるとすれば、APG反応系を阻止することによりメラノソーム形成にも影響が出るはずである。Apg7とApg3による反応を受けるためにはLC3のC末のグリシンが必要である。そこで、このグリシンを欠失させた変異LC3を過剰発現すれば、内在性のLC3がリン脂質結合型に移行する反応が抑制され、膜形成にも影響が出るはずである。このようなdominant-negative効果が期待される変異タンパクを強発現させ、メラノソーム形成への効果を調べたが、変異タンパクの発現量が内在性のLC3の量に近くはなるものの、メラノソーム形成に影響を及ぼすには至らなかった。
2.外分泌メラニン小胞の性質
ホルモン存在下で起こるメラニン形成促進には、単に細胞内のメラニン生成量が増えるだけでなく、その一部は細胞外にも放出され、培地にメラニンが貯留する効果をともなっている。培地に放出されたメラニンを含む小胞は、熟成した大きいメラノソーム顆粒は少なく、multivesicular body様の小胞で、エンドソームマーカーやLC3、GABARAPが多く含まれ、チロシナーゼに富んでいる。このことから、メラノソーム形成の中間体ともいうべき小胞がそのまま培地にエキソサイトーシスされると考えられる。

Research Products

• [Publications] Tanida, I.: "GATE-16 and GABARAP are authentic modifiers mediated by Apg7 and Apg3."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 300(3). 637-644 (2003)
• [Publications] Asanuma, K.: "MAP-LC3, a promising autophagosomal marker, is processed during the differentiation and recovery of podocytes from PAN nephrosis"FASEB Journal. 17(9). 1165-1167 (2003)
• [Publications] Nemoto, T.: "The mouse APG10 homologue, an E2-like enzyme for Apg12p conjugation, facilitates MAP-LC3 modification"Journal of Biological Chemistry. 278(4). 39517-39526 (2003)
• [Publications] Yamazaki-Satoh, H.: "The carboxyl terminal 17 amino acids within Apg7 are essential for Apg8 lipidation, but not for Apg12 conjugation"FEBS Letters. 551(1-3). 71-77 (2003)