出芽酵母のDNA複製阻害タンパク質の生理活性の同定

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380332
• Research Institution: Okazaki National Research Institutes
• Principal Investigator: 小林 武彦 岡崎国立共同研究機構, 基礎生物学研究所, 助手 (40270475)
• Keywords: リボソームRNA遺伝子 / 相同組み換え / 遺伝子増幅 / DNA複製阻害 / ゲノムの安定性 / Zn-fingerモチーフ / DNA結合タンパク質 / 出芽酵母

Research Abstract

リボソームRNAをコードする遺伝子(rDNA)は細菌からヒトの細胞に至まで多コピーで存在し、真核細胞では反復遺伝子として存在する。通常反復遺伝子ではリピート間での相同組み換えにより、コピー数が徐々に減少していくが、rDNAの場合、コピー数安定化機構が存在し、それにより例えば出芽酵母では約150コピー前後で安定に保持されている。コピー数安定化機構の一つは、組み換えにより減少したコピー数を元に戻す遺伝子増幅作用である。出芽酵母では申請者らが単離したFob1タンパク質(Fob1p)が、このrDNA増幅作用に必須な役割を果たしている。しかし今までの所Fob1pの機能についてはDNA複製阻害反応に必須であること、および核小体に局在すること以外何も判っていない。本研究の最終的な目標はFob1pの生理活性を明らかにし、遺伝子増幅の分子メカニズムを解明することである。本年度は、Fob1pの生理活性として最初に予想されるDNA結合活性を中心に解析した。その締果、1)ChIP法によりFob1pがin vivoでDNA複製阻害点(RFB)に結合していること、2)FOB1遺伝子への変異の導入実験により、Fob1pのZn-fingerモチーフがその結合に必須であること、3)精製したFob1pはゲルシフト法及び原子間力顕微鏡での観察によりによりin vitroでもRFB配列に特異的に結合すること、を見い出した。また、4)DNAフットプリント法による解析で、Fob1pはRFB内の約100bp離れた2ケ所に結合していることが判明した。現在、in vitroのDNA複製系を利用して、Fob1pとRFB配列のみで複製が阻害されるか否かを検討中である。

Research Products

• [Publications] Kodama, K.-i., Kobayashi, T., Niki, H., Hiraga, S., Oshima, T., Mori, H., Horiuchi, T.: "Amplification of Hot DNA segments in Escherichia coli"Molecular Microbiology. 45. 1575-1588 (2002)