異種動物由来物を用いない再生医療用ヒト細胞培養システムの構築

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14380406
• Research Institution: Kanagawa Academy of Science and Technology
• Principal Investigator: 伊藤 嘉浩 財団法人 神奈川科学技術アカデミー, 再生医療バイオリアクタープロジェクト, 研究員 (40192497)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 池淵 研二 東京医科大学, 医学部, 助教授 (20175194) ; 牧野 弘 財団法人 神奈川科学技術アカデミー, 再生医療バイオリアクタープロジェクト, 研究員 (00359118) ; 野川 誠之 財団法人 神奈川科学技術アカデミー, 再生医療バイオリアクタープロジェクト, 研究員 (90359117)
• Keywords: 臍帯血 / 造血幹細胞 / CD34陽性細胞 / 骨髄ストロマ細胞 / サイトカイン / 細胞固定化 / テロメラーゼ / 不死化細胞

Research Abstract

臍帯血幹細胞移植では移植細胞量に制限があり、体重の重い成人例では生着不全や移植後血球回復が遅延する例が報告されている。そのため臍帯血中の造血幹細胞をその性質(自己複製能、造血再構築能)を保持したまま体外で増幅できれば、課題を乗り越えることができる。我々はこれまで造血サイトカインの組み合わせに加え造血を支持できるストロマ細胞と共培養する系が、増幅に有効であることを報告してきた。安定した培養装置として開発する目的で、生きたストロマ細胞を固定して用い、その増幅効率を検討した。
ヒト臍帯血単核球から免疫磁気ビーズ法を用いてCD34^+細胞を純化し、1500〜2500個/ウェルで培養に用いた。テロメラーゼ遺伝子を導入し不死化したヒト骨髄ストロマ細胞(札幌医大濱田博士より供与)の単層培養を24ウェルプレートに作成し、グルタールアルデヒド、パラフォルムアルデヒド溶液で5〜30分間固定し、よく洗浄した後培養に用いた。サイトカインとしてSCF、TPO、FLを各10ng/ml濃度で組み合わせ添加した。培養2週、3週後に細胞の一部を回収し、細胞数およびコロニー前駆細胞数を測定した。一部の実験では回収細胞のCD34^+細胞比率も算定した。
培養2週目の細胞数と前駆細胞数は共に生きた(非固定)ストロマ群で最大であり1000倍以上増幅した。サイトカイン単独群では100倍程度であり、グルタールアルデヒド固定ストロマ群ではその中間の値を示した。パラフォルムアルデヒド固定ストロマ群ではサイトカイン単独群と同等であった。培養2週目の細胞中のCD34^+細胞率は生きたストロマ群で10%程度に維持されていたが、固定ストロマ群およびサイトカイン群では1〜2%まで低下していた。

Research Products

• [Publications] 劉洪春, 伊藤嘉浩: "Cell attachment and detachment on micropattern-immobilized poly(N-isopropylacrylamide) with gelatin"Lab on a Chip. 2. 175-178 (2002)
• [Publications] 伊藤嘉浩, 野川誠之: "Preparation of a protein micro-array using a photo-reactive polymer for a cell adhesion assay"Biomaterials. 24(印刷中). (2003)
• [Publications] 伊藤嘉浩: "Design and synthesis of functional polymers by in vitro selection"Polym. Adv Technol.. 14(印刷中). (2003)
• [Publications] 伊藤嘉浩: "造血幹細胞培養のための人工マトリックス"分子細胞治療. 2. 52-55 (2003)
• [Publications] 伊藤嘉浩: "先端化学シリーズIII"丸善(印刷中). (2003)