2004 Fiscal Year Annual Research Report
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14550764
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| Research Institution | Kitami Institute of Technology |
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Principal Investigator |
堀内 淳一 北見工業大学, 工学部・化学システム工学科, 教授 (30301980)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
多田 清志 北見工業大学, 工学部・化学システム工学科, 助手 (90333666)
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| Keywords | プロテオーム解析 / 二次元電気泳動 / リジン発酵 / 微生物培養フェーズ / タンパク質動態解析 |
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| Research Abstract |
平成16年度:二次元電気泳動によるリジン発酵プロセスの解析
1.目的
二次元電気泳動によるリジン生産菌内の遺伝子産物の定量・定性を行い、その経時的変化を追跡する。本年度は、種々の微生物培養フェーズにおけるタンパク質レベルの動態変化の解析を行った。
2.実験方法
菌株には、リジン生産菌であるBrevibacterium flavum(ホモセリン要求株)を用いた。容積5Lの小型発酵槽を用いて回分培養を行い、菌体増殖期、リジン生産期前期及び後期において得られた菌体サンプルを用いて、二次元電気泳動を行った。また、二次元電気泳動マップからのタンパク質の同定は、画像解析を行い、二次元電気泳動データベースを用いた。
3.結果
二次元電気泳動に用いるサンプル調製において、菌体破砕時にPMSF(プロテアーゼ阻害剤)及びアセトン沈殿法によりタンパク質を濃縮した結果、スポットの検出が大幅に改善された。特に、これまでタンパク質スポットが殆ど検出されなかったリジン生産期後期で、約320個のスポットが検出された。このサンプル調整法で、種々の培養フェーズの解析した結果、菌体増殖期では解糖系の酵素6種類とTCAサイクルの酵素3種類を同定することができた。一方、リジン生産期前期及び後期では、増殖期では検出されなかったリジン生合成に関与する酵素2種類が同定できた。これは、スレオニン存在下では協奏的フィードバック阻害のために、リジンは過剰に生産されないが、スレオニン枯渇下では協奏的フィードバック阻害が解除され、リジンの過剰生産が行われるためと考えられる。これらから、リジン生産における細胞の培養状態の変化を二次元電気泳動で解析しうることが明らかになった。
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