染色体ターゲッティングを応用した遺伝子増幅細胞の迅速構築法

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14550770
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大政 健史 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (00252586)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 内山 進 大阪大学, 大学院・工学研究科, 助手 (90335381) ; 福井 希一 大阪大学, 大学院・工学研究科, 教授 (00311770)
• Keywords: gene amplification / dhfr / MTX / バイオ医薬品 / CHO

Research Abstract

近年、ヒト由来の生理活性蛋白質・酵素・抗体などが医薬品として注目されている。これらの蛋白質は生体内に極微量にしか存在しないため、安全・安定供給などの面から遺伝子組換え体を用いた物質生産が一般的に用いられている。ヒト由来の蛋白質が生理活性を持つためには、高度な翻訳後修飾を必要とする場合が多く、高等真核生物である動物細胞での物質生産が望ましい。しかし、動物細胞における組換え蛋白質の生産性は、微生物と比較して低いことが知られており、これを上昇させるための試みが数多くなされている。動物細胞における生産性を向上させる手段の1つとして、宿主のゲノム上に存在する特定の遺伝子のコピー数が上昇する遺伝子増幅という現象が広く応用されている。しかし、遺伝子増幅現象自体のメカニズムは不明で、そのため実際の物質生産に利用可能な遺伝子増幅細胞株の構築過程には、多大な時間と労力を要している。そこで、実際のバイオ医薬品生産に最も良く用いられているChinese hamster ovary(CHO)細胞のdihydrofolate reductase(dhfr)遺伝子増幅系を染色体レベルで解析し、高頻度に遺伝子増幅する細胞株は、特定の染色体末端部位において遺伝子増幅していることを明らかにした。さらに、Cre/loxPシステムを用いたジーンターゲティングによって、この染色体末端部位へ特異的に目的遺伝子を挿入し、物質生産に有用な細胞株を効率的かつ再現性よく構築する方法を確立することを目指し、dhfr遺伝子と部位特異的組換え配列であるloxP配列を有したベクターdhfr-mloxPの構築を行った。本ベクターは、(dhfr遺伝子と、変異型loxP遺伝子を含むベクターであり、変異型loxPを含むことにより、組み込み後の切り出しを防ぐことが可能となる。