多成分同時定量用化学発光検出フロースルーセンサーの開発

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14550780
• Research Institution: University of Yamanashi
• Principal Investigator: 木羽 信敏 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 教授 (20020505)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 橘 正樹 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助手 (30020499) ; 谷 和江 山梨大学, 大学院・医学工学総合研究部, 助教授 (60115318)
• Keywords: フロー法 / 同時定量 / 化学発光 / フローセンサー / 小型化 / バイオセンサ / 生体試料

Research Abstract

半透明テフロン管を渦巻き状にしてフローセルとし、酵素を固定化した坦体を充填して光電子増倍管の測定窓に貼り付け、フローセル中での反応に基づく化学発光を直接測定した。粒子径50μmのポリビニルアルコール粒子を固定化担体とした場合、内径1mm、外径1.5mmのテフロン管は長さ70cmまでのフローセルとして使用できることが分かった。透光性、耐圧性はUV透過皮膜コーティングフューズドシリカキャピラリーが優れていたが、破損し易く、取り扱いが面倒であった。テフロン管は比較的廉価であり、多成分の同時定量では、長いフローセルを用いることにより、3成分以上の定量が可能となるので、テフロン管をフローセルとして使用することとした。担体として、チタニア、タルサイトを検討した。
多成分同時定量に必要なピークの分離度を推定するための基礎研究を行った。坦体を充填したフローセル中での試料の分散・拡散による化学発光強度(ピーク高、ピーク半値幅およびピーク面積)と流速および注入量の関係を求めた。ペルオキシダーゼを固定化したポリビニルアルコール粒子を充填したテフロン管(内径1mm)をフローセルとし、過酸化水素に基づく化学発光を測定した結果、流速が高くなるほど、ピーク半値幅およびピーク面積(全発光量)は増加し、分離度は減少した。ピーク高と流速との関係では、分散による試料と坦体との接触が最高になる最適流速が存在することを見出した。
これらの知見に基づき、ルミノール化学発光反応と酵素反応とを組み合わせ、グルコースとケトン体を同時定量できる化学発光検出法を開発した。同時固定化グルコース脱水素酵素/NADH酸化酵素/ペルオキシダーゼと同時固定化3-ヒドロキシ酪酸脱水素酵素/NADH酸化酵素/ペルオキシダーゼを直列にフローセルに充填したフローセルを、ルミノール溶液をキャリヤ溶液に用いる一流路のフローインジェクションシステムに組み込み、40〜1000nMのL-グルタミン酸と50〜1200nMのL-リシンを11/hの分析速度で定量出来た。この方法は血清分析に応用した。

Research Products

• [Publications] Kazue Tani: "Evaluation of Titania as an Ion-Exchanger and as a Ligand-Exchanger in HPLC."Chromatographia. 55. 33-37 (2002)
• [Publications] Nobutoshi Kiba: "Chemiluminometric Sensor for Simultaneous Determination of L-Glutamate and L-Lysine with Immobilized Oxidases in a Flow Injection System."Analytical Chemistry. 74. 1269-1274 (2002)
• [Publications] Ariumi Kawamoto: "Regeneration and Reuse of Hydrotalcite-Like Anion Exchanger with High Selectivity to Phosphate Anion."Journal of the Society of Inorganic Materials, Japan. 10. 167-172 (2003)
• [Publications] Nobutoshi Kiba: "Flow-through Micro Sensor Using Immobilized Peroxidase with Chemiluminometric FIA System for Determining Hydrogen Peroxide."Analytical Sciences. 19. 823-827 (2003)
• [Publications] Kazue Tani: "Retention Behavior of Monosaccharides and Disaccharides on Titania."Chromatographia. 57. 409-412 (2003)
• [Publications] Nobutoshi Kiba: "Simultaneous Determination of D-Glucose and 3-Hydroxybutyrate by Chemiluminescence Detection with Immobilized Enzymes in Flow Injection System."Analytical Sciences. 19. 1203-1206 (2003)
• [Publications] 加藤智和: "化学発光検出/高速液体クロマトグラフィーによるマルトオリゴ糖の高感度定量"分析化学. 52. 741-745 (2003)
• [Publications] Nobutoshi Kiba: "Simultaneous Determination of Choline and Acetylcholine Based on a Trienzyme Chemiluminometric Biosensor in a Single Line Flow Injection System."Analytical Sciences. 19. 1647-1651 (2003)