枯草菌の細胞壁溶解酵素の細胞壁結合ドメインの機能構造解析と応用に関する研究

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14560060
• Research Institution: Shinshu University
• Principal Investigator: 志田 敏夫 信州大学, 繊維学部, 助教授 (40162599)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 関口 順一 信州大学, 繊維学部, 教授 (80111053)
• Keywords: 枯草菌 / 細胞壁溶解酵素 / ペプチドグリカン / アミダーゼ / 結合ドメイン

Research Abstract

枯草菌のようなグラム陽性菌の細胞壁は外側からタンパク質の層、テイコ酸の層ペプチドグリカンの層から構成されている。今回の研究対象であるN-acetylmuramoyl-L-alanine amidase(アミダーゼ)はペプチドグリカンのN-アセチルムラミン酸とL-アラニンの間のアミド結合を加水分解する酵素であり、これらアミダーゼの多くは細胞壁結合ドメインを持っている。本研究の目的は細胞壁結合ドメインの立体構造を明らかにするばかりではなく、ペプチドグリカンへの結合メカニズムや局在性の仕組みの解明することである。また来年度の予定ではあるが、細胞壁結合ドメインを用いた微生物細胞表層工学、固定化酵素、融合蛋白質などへ応用するための基礎的な知見を得ることも本研究の目的としている。
本年度は特にアミダーゼCwlCの細胞壁結合ドメインの機能を調べるために細胞壁結合ドメインとGSTの融合蛋白質の発現システムの構築をおこなった。蛋白質を精製し、ペプチドグリカンへの結合力を測定した。CwlCの細胞壁結合ドメインは相同性の高い配列が2回繰返している。ペプチドグリカンへ結合するためには繰返し構造が1回分でよいことが分かった。しかし、強く結合するためには2回繰返し構造であることが必要であることが分かった。細胞壁への結合に寄与しているアミノ酸残基を特定する実験を現在行っている。また、細胞壁結合ドメインのNMR測定をおこなった。分解能の高いスペクトルが得られてたが、現在さらに安定同位体標識したサンプルを調製して解析している。