2003 Fiscal Year Annual Research Report

シネフンギン生合成酵素の大量発現と酵素化学的諸性質の解明

Research Project

Project/Area Number	14560069
Research Institution	OKAYAMA UNIVERSITY
Principal Investigator	田中英彦岡山大学, 農学部, 教授 (90065912)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	稲垣賢二岡山大学, 農学部, 教授 (80184711) 田村隆岡山大学, 農学部, 助教授 (40253009)
Keywords	シネフンギン / Streptomyces incarnatus / 抗マラリア活性 / PLP酵素 / キャピラリー電気泳動
Research Abstract	シネフンギンは放線菌Streptomyces incarnatusが生産するヌクレオシド系抗生物質である。Candida albicansに対する抗真菌活性を示すほか,トリパノゾーマ原虫にも有効でマラリアの特効薬としても期待されている。標識化合物の取り込み実験から,シネフンギンはL-アルギニンとATPから生成すると報告されている。その生合成にはピリドキサールリン酸(PLP)を補酵素とする酵素の関与が示唆されているが,酵素の実体はまったく明らかにされていない。L-アルギニンとATPを基質としてC-C結合を形成するPLP酵素はこれまでに報告がなく,シネフンギン生合成にはユニークな酵素が関与すると思われる。本研究ではシネフンギン生合成に関わる遺伝子をクローニングするために,放線菌用発現ベクターpKU110を用いて,シネフンギン生合成遺伝子(群)のスクリーニングを行う。昨年度までに,遣伝子発現ベクターpKU110の薬剤耐性マーカー(チオストレプトン耐性)をネオマイシン耐性遺伝子に変えたpTRA502の作製を行った。Streptomyces incarnatusのゲノム遺伝子を制限酵素Sau3AIで限定分解して5-6kbp程度の遺伝子断片に分画する条件検討を行った。制限酵素濃度や処理時間を変えて最適条件を検討した。アガロース電気泳動からDNAを抽出する過程においてDNAの回収が低い問題があったので,ゲルからの抽出・回収方法を種々のキットおよびキットの操作法について詳細に検討した結果,ガラスビーズに吸着させて回収するキットを用いて,撹拌を激しく長時間おこなうことにより,回収量と純度を大きく改善できた。さらに,回収した遺伝子とベクターとのライゲーション反応とそれに続く放線菌宿主Streptomyecs lividans TK24への形質転換を行ったが,組換えプラスミドを持った形質転換体の出現頻度が極めて低く,ショットガンクローニングを行うのに充分な形質転換効率が得られていない。この点についても,ライゲーションキットの選択や操作法の改良などを行っている。シネフンギン生合成能を獲得した形質転換株を選抜には,従来HPLCを用いてシネフンギンを同定しようとしてきたが,より短時間で高分解能の分析が行えるキャピラリー電気泳動を導入した。これにより一回の分析に40分程度時間を費やすHPLC分析から10分以内に分析が完了する上に,オートサンプラーによる操作の自動化が可能になり効率的なショットガンスクリーニングが可能になった。

Research Products

(5 results)

All Other

All Publications (5 results)

[Publications] Tamura, T., Sawamoto, Y., Kuriyama, T., Oba, K., Tanaka, H., Inagaki, K: "Cosynthesis of monofluoroacetate and 4-flouorothreonine by resting cells of blocked mutants of Streptomyces cattleya NRRL8057."J.Mol.Catal.B. 23. 257-263 (2003)
[Publications] Inoue, H., Nishito, A., Eriguchi, S., Tamura, T., Inagaki, K., Tanaka, H: "Purification and substrate characterization of α-Ketobutyrate decarboxylase from Pseudomonas putida"J.Mol.Catal.B. 23. 265-271 (2003)
[Publications] Arima, J., Tamura, T., Kusakabe, H., Asiuchi, M., Yagi, T., Tanaka, H., Inagaki, K: "Recombinant expression, biochemical characterization and stabilization by proteolysis of an L-glutamate oxidase from Streptomyces sp.x-119-6."J.Biochem. 134. 805-812 (2003)
[Publications] Takakura, T., Akita, K., Takimoto, A., Inagaki, K., Esaki, N., Soda, K., Mitsushima, K: "Quantitative measurement of L-methionine γ-lyase in activity in the presence of L-methionine was approached from progress curve analysis."Anal.Biochem.. (in press). (2004)
[Publications] 田代(山田)百合子, 田村隆, 田中英彦, 稲垣賢二: "Saccharomyces cerevisiae由来D-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ"岡山大学農学部学術報告. 93. 13-18 (2004)

2003 Fiscal Year Annual Research Report

シネフンギン生合成酵素の大量発現と酵素化学的諸性質の解明

Principal Investigator

田中 英彦 岡山大学, 農学部, 教授 (90065912)

Research Products

[Publications] Tamura, T., Sawamoto, Y., Kuriyama, T., Oba, K., Tanaka, H., Inagaki, K: "Cosynthesis of monofluoroacetate and 4-flouorothreonine by resting cells of blocked mutants of Streptomyces cattleya NRRL8057."J.Mol.Catal.B. 23. 257-263 (2003)

[Publications] Inoue, H., Nishito, A., Eriguchi, S., Tamura, T., Inagaki, K., Tanaka, H: "Purification and substrate characterization of α-Ketobutyrate decarboxylase from Pseudomonas putida"J.Mol.Catal.B. 23. 265-271 (2003)

[Publications] Arima, J., Tamura, T., Kusakabe, H., Asiuchi, M., Yagi, T., Tanaka, H., Inagaki, K: "Recombinant expression, biochemical characterization and stabilization by proteolysis of an L-glutamate oxidase from Streptomyces sp.x-119-6."J.Biochem. 134. 805-812 (2003)

[Publications] Takakura, T., Akita, K., Takimoto, A., Inagaki, K., Esaki, N., Soda, K., Mitsushima, K: "Quantitative measurement of L-methionine γ-lyase in activity in the presence of L-methionine was approached from progress curve analysis."Anal.Biochem.. (in press). (2004)

[Publications] 田代(山田)百合子, 田村 隆, 田中 英彦, 稲垣 賢二: "Saccharomyces cerevisiae由来D-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ"岡山大学農学部学術報告. 93. 13-18 (2004)

田中英彦岡山大学, 農学部, 教授 (90065912)

[Publications] 田代(山田)百合子, 田村隆, 田中英彦, 稲垣賢二: "Saccharomyces cerevisiae由来D-アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ"岡山大学農学部学術報告. 93. 13-18 (2004)