高次構造を基礎としたFMN結合タンパク質の酸化還元活性の発現原理

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14560075
• Research Institution: Osaka City University
• Principal Investigator: 北村 昌也 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 講師 (20244634)
• Keywords: FMN / 酸化還元電位 / タンパク質工学 / 変異体 / X線結晶構造解析 / 硫酸還元菌 / 解離定数 / フラボドキシン

Research Abstract

硫酸還元菌由来のFMN結合タンパク質について、タンパク質工学的な研究を行った。FMN結合タンパク質と分子量の点で近く、また、補欠分子族としてFMNを結合しているフラボドキシンと比較すると、アミノ酸配列上、Thr-Trp-Asnという配列だけが唯一同一であった。そこで、これらのアミノ酸残基を部位特異的変異法によって、9種類の変異型FMN結合タンパク質を遺伝子工学的に創出し、この配列がFMNとの結合や酸化還元電位にどのような影響を与えているかについて、包括的に考察した。酸化還元電位の測定には、サフラニンTをメディエーターとして用いた。野生型と比べて、Trp残基をAla、Tyr、Phe、His各残基に置換した変異体は、すべて、若干(8から18mV)正にシフトしていた。これにより、このTrp残基側鎖は、酸化還元電位について、それほど重要でないことが示唆された。しかし、FMNをペプチド鎖に結合させる点では、重要であることも明らかにしている。一方、Asn残基をGln、Asp残基に置換した変異体では、結合・酸化還元電位とも、ほとんど変化が見られなかった。Asn残基は、この3残基の中でも保存性が低いことも考えると、重要性が低いことが示唆された。Thr残基をSer残基に置換した改変体では若干(5mV)、Val残基に置換した改変体では、大きく(約60mV)負にシフトしていた。このことから、この位置が親水的な雰囲気であることが、酸化還元電位に対して重要であることが示唆された。そこで、Thr残基をVal残基に置換した改変体について、その結晶を得、X線結晶構造解析を行った。

Research Products

• [Publications] Noboru Mataga: "Femtosecond Fluorescence Dynamics of Flavoproteins : Comparative Studies on Flavodoxin, Its Site-Directed Mutants and Riboflavin Binding Protein Regarding Ultrafast Electron Transfer in Protein Nanospaces"Journal of Physical Chemistry. B106巻35号. 8917-8920 (2002)
• [Publications] Satoshi Sakamoto: "Highly Efficient Catalytic RNA Cleavage by the Cooperative Action of Two Cu(II) Complexes Embodied within an Antisense Oligonucleotide"Nucleic Acids Research. 31巻5号. 1416-1425 (2003)
• [Publications] Takeshi Nakanishi: "Cloning and Expression of the Superoxide Dismutase Gene from the Obligate Anaerobic Bacterium Desulfovibrio vulgaris (Miyazaki F)"Journal of Biochemistry. 133巻3号. 387-393 (2003)
• [Publications] Masaya Kitamura: "Cloning and Expression of the Enolase Gene from Desulfovibrio vulgaris(Miyazaki F)"Biochimica et Biophysica Acta. 1676巻. 172-181 (2004)