スギ花粉アレルゲンIgEエピトープのファージディスプレー法による検索

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14560100
• Research Institution: HIROSHIMA UNIVERSITY
• Principal Investigator: 重田 征子 広島大学, 大学院・先端物質科学研究科, 助教授 (10034381)
• Keywords: スギアレルゲン / プロテオーム解析 / ファージディスプレー / シークエンス

Research Abstract

前回までにスギ花粉アレルゲンに対する多数のアレルゲンが存在することが明らかとなった。これらアレルゲンのスギ花粉症患者血清IgEと結合するエピトープ構造を明らかにするために、今年度はファージディスプレー法を用いてIgEエピトープの解明を行うこととした。患者血清IgEは微量で沢山の種類が含まれるため、まずは市販のスギ花粉の主要抗原Cry j 1のモノクローナル抗体とランダムにペプチドを発現するM13ファージとの反応を解析した。
1、スギ花粉の主要抗原Cry j 1モノクロナル抗体と反応するファージの取得
Cry j 1モノクロナル抗体を結合したウェルにM13ファージライブラリーを加え、室温で1時間振盪した。ウェルをTBSTで10回洗浄し、モノクローナル抗体に結合したファージを0.2MGlycine-HCl(pH2.2)で溶出した。溶出したファージを1M Tris-HCl(pH9.1)15μlで中和し、大腸菌ER2738株に感染させた。精製し、溶菌させ、再度ウェルに固定化されたCry j 1モノクロナル抗体に結合させた。これらの行程を6回繰り返し、2種類のモノクローナル抗体を用いて10個のファージを取得した。さらにこのようにして得たファージをウェルに固定化して、それにCry j 1モノクロナル抗体を結合させることによって、さらに精製し最終的には3種類のファージを取得しファージDNAのシークエンス解析は行った。
2、pectate lyase Aを利用したCry j 1のホモロジーモデリング
Cry j 1はpectate lyaseという酵素の1つであるので、Cryj 1の一次構造情報を利用してこれとホモロジーが高く既に立体構造の決定されているErwinia Chrysanthemi strain EC16を用いて、Cry j 1の三次構造を推定した。

Research Products

• [Publications] 河本 正次: "Molecular cloning and characterization of a new Japanese cedar pollen allergen homologous to plant isoflavone reductase family"Clinical Experimental Allergy. 32・. 1064-1070 (2003)
• [Publications] 重田征子: "スギ花粉症のアレルゲンはどこまでわかったか?"化学と生物. 40・3. 144-145 (2002)
• [Publications] 小埜 和久: "スギ花粉、ダニ抗原の分子種構成と分子多型"アレルギー科. 14・4. 275-284 (2002)
• [Publications] 重田征子: "アレルゲンのプロテオミクス解析"臨床検査. 47・11. 1413-1420 (2003)
• [Publications] 島田弥生: "次世代スギ花粉症診断および治療技術の開発"化学工業. 55・1. 48-55 (2004)
• [Publications] 藤村 孝: "Two-Dimensional IgE-Binding Spectrum of Japanese Cedar (Cryptomeria japonica) Pollen Allergens"International Archives of Allergy and Immunology. 133. 125-135 (2004)