代謝工学的手法を用いたクエン酸からのポリグルタミン酸の生産

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14560283
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 宮武 和孝 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 教授 (70094513)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 中澤 昌美 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 助手 (90343417) ; 上田 光宏 大阪府立大学, 農学生命科学研究科, 講師 (50254438)
• Keywords: ポリグルタミン酸 / 代謝工学 / トランスポーター / 遺伝子操作 / バチルス / 大腸菌 / 機能発現 / 大量生産

Research Abstract

本年度は、以下の2点に焦点を当て研究を行った。
1)枯草菌のクェン酸様トランスポーター遺伝子の、納豆菌への導入
2)遺伝子の発現ついて
これまで設計したプライマーを用いて、yraO遺伝子のシャトルベクター(pHY300PLKDNA)へのクローニングを試みた。このプライマーは、yraOのORF、プロモーター、ターミネーター領域を含むように設計されたもので、これらのプライマーを用いて枯草菌のゲノムDNAを鋳型にPCRを行ったが、pHY300 PLK DNAがただのクローニングベクターで発現ベクターではないため、形質転換したとしても、細胞中で発現するかどうか疑問であると判断し、現在大腸菌と枯草菌の新しいシャトルベクター(pDG148-Stu)を用いて、納豆菌中でのyraO遺伝子の発現を試みている。これまで、新たにプライマーを設計し直し、PCRによるyraO遺伝子の増幅を試みたところ、予想される分子量と等しい長さのDNAフラグメントを得ることができた。そこで、このフラグメントを用いて、pDG148-Stuとのライゲーションを試み、派生したプラスミドを用いて、「プロトプラスト法による納豆菌へのyraO遺伝子の導入」を試みている。納豆菌RNAのノザンブロッティングのプローブとして用いる5種類の遺伝子のクローニングは成功した。今後、ノザンブロッティングを行い、その発現量の調節と機能を解明するため、ISOGENというkitにて、納豆菌からのRNA抽出をおこなっている。より効率的に行うため、抽出方法の改良を検討中である。

Research Products

• [Publications] M.Nakagawa, S.Takenaka, M.Ueda, H.Inui, Y.Nakano, K.Miyatake: "Pyruvate : NADP^+ oxidoreductase is stabilized by its cofactor, thiamin pyrophosphate, in mitochondria of Euglena gracilis"Archives of Biochemistry and Biophysics. 411. 183-188 (2003)
• [Publications] 共著: "食の安全(担当分)環境ホルモンの恐怖 141-172ページ"NTS. 244 (2003)