2002 Fiscal Year Annual Research Report
リボザイム、カタリチックDNAを用いたSOD変異によるALSの遺伝子治療
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14570582
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
横田 隆徳 東京医科歯科大学, 医学部附属病院, 講師 (90231688)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水澤 英洋 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (30144091)
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| Keywords | G93Aトランスジェニックマウス / RNAi / siRNA / 遺伝子治療 / SOD / リボザイム / カタリチックDNA / 筋萎縮性側索硬化症 |
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| Research Abstract |
mRNAを配列特異的に切断する方法として最近short interference RNA(siRNA)が開発されたため、SOD1 mRNAに対するsiRNAを作製してリボザイム、カタリチックDNAとその効果について比較検討した。野生型およびG93A SOD1 mRNAの2次構造の解析から数カ所に19mer RNAとTTの3'overhangからなるsiRNAをデザインした。HEK293TおよびN2a培養細胞にsiRNAとSOD1発現ベクターと共発現させて、有効なsiRNA配列をスクリーニングした。SOD1mRNAの2次構造上もっとも大きな1本鎖のループ構造をとる部分にin vitroでは90%以上の切断活性のあるribozymeとDNA enzymeを作成した。siRNAは培養細胞の内因性SOD1タンパクを配列特異的に認識して、有効にタンパクの発現を抑制し、その抑制効率はリボザイム、カタリチックDNAよりはるかに高かった。さらにALSに関連する点変異であるSOD1の遺伝子変異について、siRNAはその1塩基の違いを認識して、野生型mRNAにはほとんど影響せずに、変異mRNAを特異的に発現抑制した。加えて、有効なsiRNA配列をtRNA promotor, U6 promotor,独自のtandem型^<2)>,stem型^<3)>の各種デザインした発現型DNAベクターで構築し、その有効性を比較検討したその結果、U6 promotor下のstem型の発現型siRNA vectorが最も有効であった。
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