HIVウイルスベクターを用いた遺伝子機能解析法の開発

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14570814
• Research Institution: 大分医科大学
• Principal Investigator: 園田 祥子 大分医科大学, 医学部, 助手 (80253780)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 鵜島 雅子 大分医科大学, 医学部, 助手 (90336256) ; 平松 和史 大分医科大学, 医学部, 助手 (80301381) ; 中島 一敏 大分医科大学, 医学部, 助手 (90305037)
• Keywords: HIVウイルスベクター

Research Abstract

H14科研 研究実績報告書
本年度は、GFP発現HIVウイルスベクターの調整と導入効率について実験を行った。
1、GFP発現HIVウイルスベクターの調整
各プラスミド、1)パッケージングプラスミド、2)Revプラスミド、3)エンベローププラスミド、4)SINベクタープラスミドをコンピテントセル(JM109)に形質転換し、大量培養を行った。プラスミド調整キット(QIAGEN社)を用いて精製度の高いプラスミドDNAをmg単位で調整した。これら4つのプラスミドDNAを293細胞(human embryo kidney由来)に様々な条件下でトランンスフェクションした。トランスフェクション後2日目より蛍光顕微鏡にて、293細胞のGFPの発現を確認し、3日目にその培養上清をHIVウイルスベクターとして得ることができた。
2、GFP発現HIVウイルスベクターの力価の測定
1)サンドイッチELISA法によるウイルス蛋白の定量
HIVのカプシド蛋白であるp24に対する抗体を用いてサンドイッチELISAを行った結果、培養上清中のp24蛋白量は、約2ng/mlで、理論上10^3TU(transfection unit)/mlの力価を得た。
2)ウイルスベクターの感染価の測定
この培養上清の細胞に対する感染価を調べるため、293細胞に感染を試みたところ、1:10の希釈倍率まで、GFPの発現を確認できた。
3、現在、ウイルスベクターの感染価を上げるため、プラスミドDNA導入効率の条件、ウイルスベクターの濃縮法について、検討を行っている。