肝再生および肝発生における肝類洞内皮細胞新生の分子制御機構に関する実験的研究

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571197
• Research Institution: Shimane University, Faculty of Medicine
• Principal Investigator: 小野 隆司 島根大学, 医学部, 助手 (50304267)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 八田 稔久 島根大学, 医学部, 助教授 (20238025) ; DHAR D. K 島根大学, 医学部, 助手 (10284035) ; 山野井 彰 島根大学, 医学部, 講師 (70281152)
• Keywords: 肝再生 / 血管新生 / 血管新生因子 / HIF-1α / VEGF / flt-1 / mT0R / MIF

Research Abstract

平成11-12年科研費以来、ラット肝切除後肝再生時の類洞内皮細胞新生を形態的変化、血管新生因子の発現を中心に検討してきた。今回、血管新生因子発現の重要な転写因子であるhypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)の肝再生中の変動とその意義を中心に検討した。さらに、一過性の虚血変化で誘導されるmTOR(mammalian target of rapamycin)、MIF(macrophage migration inhibitory factor)も検討した。8-10週齢、雄のSDラットに70%肝切除を行い、再生肝における肝細胞、類洞内皮細胞の増殖をbromodeoxyuridine(BrdU)の取り込みで評価した。またRECA-1抗体を用いて内皮細胞を免疫染色し、類洞内皮細胞の肝組織中に占める割合を血管密度(MVD)の画像解析で評価した。さらに肝切除前、切除後6、12、24、36、48、72、120、168時間の核内蛋白でHIF-1α、細胞質でVEGF、flt-1 mTORおよびMIFをwestern blot法を用いて半定量を行し、HlF-1α発現は免疫染色で確認した。また、RT-PCR法にて血管内皮細胞増殖因子であるHIF-1α、VEGFとflt-1のmRNAの発現を測定した。肝細胞、内皮細胞のBrdU取り込みは、各々肝切除後24時間、72時間で最高値を示した。MVDは肝切除後72時間まで減少し、96時間では上昇した。HIF-1αの発現は肝切除後6、12、24、36時間で高値を示し、肝切除24時間後でHIF-1αの発現が最も高かった(P<0.01)。HIF-1αmRNAは肝切除後24、36、72時間で有意に高かったP<0.05)。免疫染色でも切除後24時間で肝実質にHIF-1αが高発現していた。VEGFの蛋白発現は肝切後120時間で有意に上昇し、VEGFのmRNAの発現は、肝切後48時間から増加し、72時間で最高値に達した(P<0.05)。flt-1は肝切後48時間から96時間まで増加を認めた(P<0.05)。mTORは肝切除後72時間で一過性に減少した(P<0.05)。MIFは肝切除早期(12-36時間)(P<0.01)および168時間(P<0.001)で上昇した。肝切除後の肝細胞増殖早期に肝細胞は群塊を形成し、この時期に類洞内皮細胞を含めた肝組織全体に一過性の虚血状態が生じ、HIF-1αの転写活性により血管新生因子とその受容体の発現を誘導したと考えた。mTORは細胞の増殖、大きさを規定することが知られ、群塊形成期の肝細胞分裂増殖と一致して発現が低下した。MIFは細胞増殖維持への関与が知られ、肝細胞増殖に先行して上昇し、類洞再構築後も上昇し続けた。肝再生中の類洞内皮細胞の新生は一過性肝虚血で誘導されるHIF-1αの発現が、肝再生制御に重要な役割を演じる可能性が示唆された。