放射線増感promoterを用いた血管内皮前駆細胞併用glioma自殺遺伝子治療

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571350
• Research Institution: Chiba Cancer Center (Research Institute)
• Principal Investigator: 大賀 優 千葉県がんセンター, 脳神経外科・化学療法研究部, 医長・兼務研究員 (10251159)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 幡野 和男 千葉県がんセンター, 放射線治療部, 部長 ; 竹永 啓三 千葉県がんセンター, 化学療法研究部, 主席研究員 (80260256)
• Keywords: 放射線増感 / Egr-1 / CArG element / 遺伝子治療 / glioma / 自殺遺伝子

Research Abstract

初年度は、放射線増感promoter(E4:Egr-1 gene中のCArG elementの4回くり返し構造とCMVのchimeric promoter)を組み込んだ各種plasmidを作成し、glioma cell lineにそれらを導入して、放射線照射により実際に放射線増感promoterの下流の遺伝子発現が増幅するかどうかを確認した。PlasmidはpCI-neo plasmid vector (Promega)を母体として作成した。放射線増感promoterの下流にはEGFP, HSV-tkを組み込んだ。Control vectorとして、CMV promoterを有する各種plasmid(pCI-neo/EGFP, pCI-neo/HSV-tk)も同時に構築した。ついでU251-MG/U373-MG glioma cell lineにE4/EGFPを導入し、3Gyを照射して蛍光顕微鏡下観察およびWestern blottingで評価したところEGFP発現強度は照射3-48時間後で照射前の1.3-1.4倍に増強することが確認された。ついでE4/HSV-tkとHSV-tkを導入しGCV投与後に放射線(1,3,5Gy)を照射しMTT assayで評価したところ、i)放射線照射をしなくともE4/HSV-tk導入群が著明に死滅した。このことからE4が放射線以外の刺激、すなわちtrypsin処理や懸濁等の物理的/化学的刺激で下流の遺伝子発現を増幅してしまう可能性が示唆され、これら物理的/化学的刺激の影響を最小限にする実験系を組み立てる必要があると判断された。ii)E4/HSV-tk導入群は線量依存的に細胞死は促進されるが、controlであるHSV-tk導入群にくらべて統計学的に有意ではなかった。このことからE4以外のより強力なenhancerの選択を考慮すべきであることが示唆された。