妊娠中毒症の発症における絨毛の増殖、分化異常の解析一細胞周期と酸化ストレスの関係

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571557
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 井阪 茂之 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (50346201)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 下屋 浩一郎 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (40291950) ; 木村 正 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (90240845) ; 古山 将康 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (00183351) ; 辻江 智子 大阪大学, 医学系研究科, 助手
• Keywords: 子宮内膜 / 絨毛細胞 / サイクリン依存性キナーゼ / サイクリン依存性キナーゼインヒビター

Research Abstract

子宮内膜における残存絨毛細胞の同定と精製
1.男児の出産歴を有し、月経周期のある非妊婦婦人の子宮摘出手術時に、患者の同意のもと、子宮内膜および子宮筋層浅層を採取し、一部から凍結標本を作成し、その残りより、RNAおよびDNAを抽出した。
2.採取した細胞から、DNAを採取した後、Y染色体特異的なSRY遺伝子のprimerを用いてreal-timePCRを施行し、Y染色体の存在を示唆する結果を得た。
3.凍結切片標本から連続切片を作成し、HCG、HPLに対する蛍光免疫組織二重染色を行い、HCG、HPL陽性細胞の存在を同定し、HCG、HPL陽性細胞を認めた切片より、laser capture microdissection(LCM)を用いて、HCG, HPL陽性細胞のみを選択に採取する方法を準備中。
絨毛細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ(CDK)とそのインヒビター(CDKI)の発現解析
1.患者の同意を得て、人工妊娠中絶時、早産時、満期産時に絨毛細胞を採取し、蛋白を抽出し一部をパラフィン包埋した。
2.妊娠各期の絨毛細胞にCKIである、p21,p27,p57の発現をウェスタンブロットにて確認した。P21とp27の発現量は胎盤完成を境に逆転していた。
3.p21,p27,p57の絨毛細胞におけるlocationを免疫組織染色にて確認した。
4.絨毛細胞より抽出した蛋白に対し、抗CDK2抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿物を回収し、pRbを基質とし、[γ-32P]ATPを添加したCDK2のキナーゼ活性測定系を用い、CDK2のキナーゼ活性を測定した。
5.絨毛細胞より抽出した蛋白に対し、抗CDK2抗体を用いて免疫沈降を行い、沈殿物を回収し、抗p21およびp27抗体を用い、CDK2とp21およびp27の結合状態により、CDK2活性の抑制能を解析した。