2003 Fiscal Year Annual Research Report
Directed EvolutionによるSODのin vitro分子進化
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14571781
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| Research Institution | Matsumoto Dental University |
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Principal Investigator |
平岡 行博 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 教授 (20097512)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
奥村 茂樹 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (80350825)
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| Keywords | 活性酸素 / SOD / スーパーオキシドジスムターゼ / 金属酵素 / 酸化還元酵素 / 金属選択性 / 部位特異的変異 / Porphyromanas gingivalis |
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| Research Abstract |
<目的>歯周病原菌の一種であるPorphyromonas gingivalis(P.g.)のスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)は、マンガンと鉄の何れの金属でも活性を持ち、含有する金属によってそれに応じた化学的性質を示す特徴がある。本研究は、金属配位近傍のアミノ酸残基の役割を推測し、部位特異的変異酵素を作製して金属選択性に関わる構造を検討する一方、分子進化の理論をin vitroで再現して金属特異的SODに変化させた酵素を得ることを最終目的とした。
<方法>1-立体構造の結果からFe-特異的SODに特徴的なアミノ酸を推定し、Kunkelの方法でP.g SODのGly 155 Thr変異酵素を得た。
2-Stemmerらの開発したDNAシャフリング(Proc.Nat.Acad.Sci.94:4504-9,1997)に従い、SOD欠損大腸菌に入れてライブラリーとした。パラコート添加によって活性酸素を発生させながらMn、あるいはFe濃度を高めた最小培地でスクリーニングして活性のより高い酵素を選択した。
<結果>P.g.SODのThr155の1残基変異酵素でFeに対する特異性が高くなることを、活性の金属依存性、吸収スペクトルおよびEPRスペクトルにより確認した。この結果はcambialistic SODの金属特異性をFe-特異的SODに変換させることに成功した初の成果である。既報のMn特異性に寄与するアミノ酸残基と併せ、Fe-特異的およびMn-特異的SODの優性配列が特定できたことから、Directed Evolutionによる定向進化の検討が容易になった。ライブラリー作製に適したSOD欠損菌株を検討した結果、QC1799が他の株より形質転換効率が高かった。
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[Publications] Hiraoka, B.Y., et al.: "Pronounced conversion of the metal-specific activity of superoxide dismutase from Porphyromonas gingivalis by the mutation of a single amino acid (Gly 155 Thr) located apart from the active site."Biochemistry・US. 42. 10790-10799 (2003)
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[Publications] Yamakura.F.et al.: "Structural bases for the conversion of the metal-specific activity of Porphyromonas gingivalis superoxide dismutase by G155T mutation"生化学. 75. 796-796 (2003)
