歯周組織の加齢に伴う形態学的変化とその分子機構の解明

2003 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14571851
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 坂井 貴子 九州大学, 大学病院, 講師 (60128022)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 坂井 英隆 九州大学, 大学院・歯学研究院, 教授 (80136499) ; 小林 家吉 九州大学, 大学院・歯学研究院, 講師 (40243951) ; 松尾 拡 九州大学, 大学院・歯学研究院, 助教授 (70238971) ; 寺田 善博 九州大学, 大学院・歯学研究院, 教授 (30038898)
• Keywords: 加齢 / 歯周組織 / アポトーシス / 老化遺伝子

Research Abstract

1.歯周組織におけるアポトーシスの発現の特異性に関する検索
生後5週齢から70週齢までの雄C3Hマウスの下顎第一臼歯の歯周組織、頬粘膜、舌粘膜、唾液腺、皮膚、腎臓および肝臓を採取し、凍結切片を作製した。TUNEL法によりapoptotic cellを染色した。同時に生後5週齢から70週齢までの雄C3HマウスにBrdUを腹腔内注射の後、下顎第一臼歯の歯周組織、頬粘膜、舌粘膜、唾液腺、皮膚、腎臓および肝臓を採取し、凍結切片を作製し、BrdU染色により各組織の増殖中の細胞を染色した。各組織に、加齢によるアポトーシスの発現状態の差があるか否か、細胞増殖に加齢による変化があるか否かを統計的に解析している。
2.cDNA subtraction法によるアポトーシス関連遺伝子の検出
アポトーシスが発現する直前の10週齢と、アポトーシスが増加中の15週齢マウスの下顎臼歯の歯肉組織を採取後ただちにホモジナイズし全RNAを抽出した。すべてのRNAをcDNAに変換し、PCR-selected cDNA subtraction法により、上記のサンプル間で互いにsubtractionを行った。各々の週齢に特異的に発現する遺伝子群を得た後、大腸菌にトランスファーしてライブラリー化した。Subtractionされ、PCRにより増幅された週齢に特異的なcDNAや、subtrac-tionされていない各週齢のcDNAをテンプレートにして、ジゴキシゲニン標識のプローブを作成し、それぞれのライブラリーの大腸菌のコロニーをピックアップしてメンブレン上でのハイブリダイゼーションを行い、週齢に特異的に発現するコロニーを同定した。セレクトされたコロニーについて非放射線同位元素を用いたシークエンスシステムでDNA配列を調べた。