DNA二重鎖切断発生後、傷害部位に集積するプロテインキナーゼPKUの機能解析

2002 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 14572146
• Research Institution: Kanazawa Medical University
• Principal Investigator: 伊達 孝保 金沢医科大学, 医学部, 教授 (50019676)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松井 理 金沢医科大学, 医学部, 助手 (60288272) ; 濱田 富美男 金沢医科大学, 医学部, 助手 (80240779) ; 岩淵 邦芳 金沢医科大学, 医学部, 助教授 (10232696)
• Keywords: PKU / X線照射 / IRIF / RNAi / 53BP1 / PKU結合タンパク質

Research Abstract

1)HeLaまたはMCF7細胞にX線を照射し、抗PKU-βポリクローナル抗体を用いて染色すると照射後6時間めあたりから核にIRIFが見られた。MCF7細胞からの細胞抽出液を用いて免疫沈降を行ったところ、3本のバンドが認められ、そのうちの移動度の大きい二つのバンドは、遺伝子導入実験からPKUのisoformであると推定された。
2)PKU遺伝子を上記細胞に導入すると核質が均一に染まる。遺伝子導入細胞を免疫沈降してWesternで調べたところ、endogenousの由来のPKUと完全に一致した。しかし、この細胞はPIRIFを形成しなかった。過剰発現が原因として、洗浄条件などを検討したがIRIF形成を見る細胞を得ることはできなかった。
3)抗PKU-β抗体と抗53BP1抗体のIRIFは一致したが、PKUと53BP1の間には何ら相互作用が見られなかった。
4)PKU発現を抑制するとIRIFが見られなくなることを予想し、数種の変異PKUを作成し、endogenous PKUのIRIF形成を抑制するdominant negativeの組換え体を探したが、そのような組換え体を見い出すことはできなかった。そこで、PKUの配列の一部をもつdsRNAをMCF7に導入し、RNAiによるPKUの発現抑制を試みた。しかし複数箇所こころみたにもかかわらず発現を抑制させることはできなかった。現在、別のRNAを作成し発現抑制を試みている。
5)しかし、MCF7細胞にHA-tagつきのPKUを導入し、X線照射した後、抗HA抗体で免疫沈降し、SDS-PAGEで調べたところX線照射で誘導されるPKU結合タンパク質60kDaを見つけた。現在このバンドの同定を行っている。